二、土壤微生物量碳、氮的测定方法—熏蒸提取法
1．主题内容与适用范围
本方法采用氯仿熏蒸—提取测定土壤微生物量碳、氮，适用范围广，既适用于中性和
微碱性土壤，也适用于强酸性土壤，并且适用于滞水土壤（如水稻土）和新施有机肥
土壤。
2．方法提要
土样经氯仿熏蒸和未熏蒸两种不同处理后，用K2SO4溶液浸提，提取液一部分用K2CrO7
（重络酸钾）氧化法测定微生物量碳，另一部分用浓H2SO4消煮、碱化蒸馏法测定微生
物量氮。
3．提取液的制备
仪器、设备：抽气皿（真空干燥器）、无醇氯仿、抽气机、大铝盒、分析天平（感量：）、小
烧杯（50ml）、大塑料瓶（250ml）、大三角瓶（150ml）、40C的冰箱、定量
滤纸（15cm）、漏斗、保鲜膜
试剂的制备： M K2SO4溶液（化学纯）、
无醇氯仿（提纯方法：用1N H2SO4溶液与氯仿(CHCl3三氯甲烷)按体积比2:1
于分液漏斗中振荡混匀，净置分离，共做3次；再用水代替硫酸与氯仿2:1
混匀，振荡分离，共5次，将提纯的氯仿放入到棕色试剂瓶中，加一勺无
水硫酸钠，保存）
分析步骤：
称取鲜土(取土要准确、均匀，不要夹入有机残体)于大铝盒中。
在抽气皿中放入盛有25ml
无醇氯仿的小烧杯，小烧杯中放几张小纸片以便于观察沸腾。
放入装土的大铝盒，连上抽
气机，抽真空使氯仿沸腾5分钟，关紧活塞，关闭抽气机。
包上黑布，置于阴暗处（250C）熏蒸24小时。
到时间后，取出小烧杯后反复抽真空2~3次（每次5分钟），排除氯仿。
另称取一批同等重量的土放入大塑料瓶中，不做熏蒸处理，同样包上黑布，置于阴暗处24小时。
将步骤中的两批土样转移到离心管中（红壤适宜离心管）。
用注射器注入每瓶50ml K2SO4
溶液，盖紧瓶塞，振荡30分钟，离心5分钟后取出，用15ml定量滤纸过滤到150ml大三
角瓶中，应立即测定。
如不立即测定，用保鲜膜封口（防止污染和挥发），保存在40C的冰
箱中。
4．生物量碳的测定—K2CrO7氧化法
仪器、设备：DOC测定仪(冷凝装置4套、配套沸瓶装16个)、玻璃沸珠、1500W电炉两个、
变压器两个、滴定管（25ml）
试剂的制备：蒸馏水、混合酸(浓硫酸:浓磷酸=2:1,分析纯) 、 K2CrO7标准溶液
邻菲罗啉指示剂、（ N）K2CrO7溶液（L，分析纯）
(NH4)2Fe(SO4)2溶液：取L溶于蒸馏水，用20ml浓硫酸（98%，分析纯）
酸化，而后定容至1L、
分析步骤：
吸取2ml N K2CrO7溶液放入沸瓶，再吸15ml 混酸放入沸瓶，混合，加入等量的玻璃球（约
一小药匙，10个）。
吸取步骤（）中的过滤液8~10ml（根据含碳量多少而定），放入到电炉
上，安装好冷凝系统，调压至130伏开始加热。
从玻璃球沸腾时开始记时，保持沸腾30分
钟，其间应摇匀两次。
在30分钟到前2分钟关上电炉，利用余热保持沸腾至30分钟，随后从冷凝管上口加入20ml蒸馏水，清洗冷凝管壁，降低沸瓶温度。
取下沸瓶，待冷却至室温，加入2~3滴指示剂，用准确标定过的(NH4)2Fe(SO4)2溶液滴定。
颜色从黄色→深绿色→天蓝色→浅灰色（很短暂）→红棕色到终点。
同时用 K2SO4代替过滤液作空白，注意两个电炉间的差异。
注：(NH4)2Fe(SO4)2溶液的标定：在三角瓶内放入 N K2CrO7标准溶液10ml，加入混合酸15ml，摇匀冷却，用(NH4)2Fe(SO4)2溶液滴定，颜色反应同上。
一般在测定开始和结束时各标定一次，取平均值，保留4位小数。
分析结果的表述：
计算公式：（1）C（ug/ml）=[(V空白—V样品)*N(NH4)2Fe(SO4)2*3*1000]/吸取样品的体积数(ml)（2）C（ug/g）=[C(ug/ml)*提取液的总体积数(ml)]/W干土(g)
（3）EC（ug/g）=C熏蒸（ug/g）—C未熏蒸（ug/g）
（4）微生物量碳BC（ug/g）=EC/（ug/g）
允许差
取平行测定结果的算术平均值作为测定结果（一般做两次重复）。
平行测定的绝对差值≤10ug/g。
（要求样品滴定时的绝对差值≤）
5．微生物量氮的测定—消煮、碱化蒸馏法
仪器、设备：定氮仪、烘箱、开氏瓶（50ml）、移液管（50ml、2ml、5ml）、小漏斗、小三角瓶（150ml）
试剂的制备：去离子水、浓硫酸（化学纯）、硼酸指示剂、10M NaOH溶液（化学纯）、CuSO4溶液
分析步骤：
吸取步骤中的过滤液25-30ml放入到开氏瓶（三角瓶）中，加入2ml浓硫酸（固定滤液中的氨）。
放入到烘箱中在60~700C烘2~3天，直至瓶内还剩下3ml左右溶液，取出。
加入3ml浓硫酸和溶液，放上小漏斗在电炉上消煮。
消至瓶内颜色呈天蓝色为止，取下冷却。
同时用 K2SO4溶液50ml代替滤液作空白。
用去离子水洗清小漏斗内外壁，少量多次冲洗开氏瓶，将开氏瓶中的液体全部转移到定氮仪中，加入20ml 10N NaOH溶液进行碱化蒸馏，冷凝管下口放装有5ml硼酸指示剂的小三角瓶，接收蒸馏液，待蒸馏液达到60ml时停止蒸馏。
蒸馏前应检查蒸馏装置是否漏气，并进行空蒸馏清洗管道。
用硫酸标准溶液滴定馏出液，加入指示剂，颜色由蓝色刚变成紫红色为终点，记录消耗硫酸标液的体积。
分析结果的表述：
计算公式：N （ug/g）=[(V—V0)*N H2SO4**稀释倍数*1000*]/W烘干土
微生物量氮BN（ug/g）=N熏蒸—N未熏蒸
其中： V ：滴定样品所消耗的硫酸数，ml；
V0：滴定空白所消耗的硫酸数，ml；
稀释倍数：总过滤液是所吸取的过滤液的倍数，；
：无机氮转化为有机氮的转化系数。
允许差
取平行测定结果的算术平均值作为测定结果（一般做两次重复）。
平行测定的绝对差值≤5ug/g。
（要求样品滴定时的绝对差值≤）。