Oasis HLB柱（聚合物基质）
离子交换与反相模式 混合的固相萃取
离子交换 反相作用
•强阳离子和反相双重保留基质 •常用于提取净化生物基质中的 弱碱性化合物 •酸性环境中含氮碱性基团与磺 酸基结合 •酸性药物呈分子状态发生反相 结合作用
离子交换与反相模式 混合的固相萃取
固相萃取法方法总结
SPE优点：
生物样品常用的处理方法
主要考虑生物样品的种类、被测药物的性质和测定方 法三个方面的问题：
一
二
三
沉淀蛋白 (PPT)
液液萃取 (LLE)
固相萃取 (SPE)
固相萃取技术(SPE)
固相萃取(Solid Phase Extraction，简称SPE)是从
八十年代中期开始发展起来的一 项样品前处理技术。由液固萃取 和液相色谱技术相结合发展而来。 主要通过固相填料对样品组分的 选择性吸咐及解吸过程，实现对 样品的分离，纯化和富集。主要 目的在于降低样品基质干扰，提 高检测灵敏度
基质效应评价方法
柱后灌注法 提取后加入法（相对基质效应评价）
•MF：基质效应因子 •MF=Set 2/Set 1 •IS-normalized MF : 内标归一化基质效应因子
血浆
血浆
➢将采取的血液置含有抗凝剂 （如肝素、EDTA)的试管中，混 合后，3000-4000r/min离心，分 离红细胞，上清液即为血浆。 ➢测定血中药物浓度通常是指测 定血浆或血清中的药物浓度，而 不是指含有血细胞的全血中 的 药物浓度。
血清
血清
➢血清是采血后不加任何抗凝剂， 于室温下静置15-30min，待其自 然凝结后，离心，分离出上清液。 ➢血清较血浆颜色更浅，较血浆 少了大部分纤维蛋白，更易进行 处理，且血浆及血清中的药物浓 度测定值通常是相同的。
常用液-液萃取溶剂
极性增加
➢相似相溶原理进行选用 ➢沸点低、易于挥散和浓集 ➢无毒、不易乳化 ➢具有较高的化学稳定性和惰性 ➢和水不相溶
正己烷 叔丁基甲醚 乙醚 乙酸乙酯 正丁醇
二、有机溶剂和水相的体积比
➢有机溶剂相和水相的体积比1:1或2:1，由实际情况决定，文献中有10:1以上
三、水相的PH值
➢对于碱性药物，最佳PH要高于药物PKa1-2单位， ➢对于酸性药物，最佳PH要低于PKa1-2单位， ➢使药物分子以非电离的形式存在，从而更易溶于有机溶剂中
药物浓度低（血液中药物浓度、 一般处于ng-pg级水平）
干扰组分多（血液成分及其复杂， 包括基质，内源性物质及其代谢产物，
含有数百乃至几千种化合物）
药物在体内除原型还有代谢产物以及 和内源性物质结合多种形式存在
生物样品种类
生物样品种类选取的原则
➢能够反应出药物浓度与药物效应之间的关系 ➢易于获取 ➢便于处理、适合分析 ➢根据不同目的要求进行选取
生物样品的储存和预处理 (添加酶抑制剂)
体内胆碱酯酶的 作用下缓慢代谢
盐酸班布特罗（前药）
阻断水解 特布他林（代谢产物）
毒扁豆碱 (胆碱酯酶抑制剂）
生物样品的储存和预处理(避光）
生物样品的储存和预处理 (PH值和温度）
生物样品预处理目的
1
2
3
➢将药物从缀 合物（尿）或 结合物中释放 出来，以测定 药物浓度
常用中性盐种类
•饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐、枸橼酸盐
操作实例
•血清和饱和硫酸铵的比例为1:2，混合，离心10000r/min 1-2min， 即可除去90%以上蛋白质
生物样品常用的的性质和测定方 法三个方面的问题：
一
二
三
沉淀蛋白 (PPT)
液液萃取 (LLE)
选择血浆or 血清
选择血浆理由：
1)一般血浆中药物浓度高于血清中药物浓度 2)血清形成过程中，血块凝固时，往往易造成吸附 损失 3)血清需要采血放置一段时间才可制得，对不稳定 的化合物影响较大 4)血浆则可经采血后立刻离心，分离血浆低温保存
选择血清理由：
1)血浆中蛋白稍微多，可能会在SPE中产生堵塞 柱子情况 2)血浆中含有抗凝物质（肝素或EDTA)可能会干 扰化合物检测
加入强酸实例
头孢地尼
内标 头孢克洛
酶解法
原理
➢在测定酸不稳定及蛋白结合牢固的药物，需用酶解法，最常用的酶 是蛋白水解酶的枯草菌溶素，
优点
➢可避免某些药物在酸、及高温条件下降解：对与蛋白质结合牢固的 药物（保泰松、苯妥英钠)，可显著改善回收率
加入中性盐
原理
➢加入中性盐，使溶液的粒子强度发生变化。中性盐能将与蛋白质水 合的水置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。
奥氮平
有机溶剂沉淀法
经验总结
➢血浆或血清与有机溶剂的体积比为1:1~3，就可以将90%以上的蛋白质 除去，采用低温低速3500r/min离心10min便可将析出的蛋白质完全沉淀。
优点
➢操作简单，快速，精密度好，为方法开发中优先考虑使用的，特别在 LC-MS方法中 ➢几乎使用于所有小分子化合物，无论其极性大小 ➢化合物回收率接近100%，几乎所有小分子化合物都被提取，尤其适用 于代谢产物鉴定
➢将微量药物 从复杂介质中 纯化、富集起 来
➢防止分析仪 器的污染，提 高测定灵敏度 和选择性
生物样品常用的处理方法
主要考虑生物样品的种类、被测药物的性质和测定方 法三个方面的问题：
一
二
三
沉淀蛋白 (PPT)
液液萃取 (LLE)
固相萃取 (SPE)
沉淀蛋白
通过沉淀蛋白质可以使结合的药物释放出来，达到对待测组分的 提纯和纯化
固相萃取分离类型
反相固相萃取
➢硅胶上键合C18，C8，C2，苯基，腈基 ➢流动相极性大于固定相，适合分离中小极性的化合物的萃取 ➢疏水性相互作用
正相固相萃取
➢无键合硅胶、或硅胶上键合氰基、NH2、二醇基 ➢流动相极性小于固定相，适合于极性的化合物的萃取 ➢亲水性相互作用
离子交换萃取
➢硅胶基质的离子交换官能团，季胺，氨基、二氨基、苯磺酸基、羧基 ➢带有电荷的化合物靠静电吸引到带有电荷的吸附剂表面
基质效应及其影响
基质效应（martix effect）：
➢定义：样品测试过程中，由于待测物以外的的其它 物质存在，直接或间接影响待测物相应的现象 ➢如测定血液中的红霉素浓度为例，除了红霉素之外 的蛋白、磷脂、及其它内源性物质为基质 ➢共流成分会改变待测化合物的离子化效率，引起对 待测化合物监测信号的抑制或提高
吸附型萃取
➢采用极性较强的硅胶、硅藻土和氧化铝等吸附剂
固相萃取和HPLC相比的特点
➢ SPE也是一个柱色谱分离过程，分离机理、固定相 和溶剂的选择等方面与高效液相色谱（HPLC）有许多 相似之处。
➢ 但是SPE柱的填料粒径（>40µm）要比HPLC填料 （3~10µm）大。由于短的柱床和大的粒径，SPE柱效 比HPLC色谱柱低得多。
Oasis HLB柱（聚合物基质）
Oasis HLB柱（聚合物基质）
➢亲水亲脂柱的优点
•亲水基团（吡咯烷酮基团）和疏水基团（二 乙烯基苯）,对极性化合物和非极性化合物均 有较好的保留，具有亲水亲脂平衡的特性 •具有水可润湿性，填料经活化后，即使柱床 干涸，吸附剂对目标物的保留也不会发生变化 •有机聚合物而非硅胶，在pH 0-14 的范围内 表现稳定 •有机聚合物基质的吸附剂，不存在次级相互 作用，用于碱性化合物能够得到满意的结果
有机溶剂 沉淀法
加入中 性盐
有机酸
加入锌盐 或铜盐沉
淀剂
酶解法
有机溶剂沉淀法
原理
➢加入水溶性有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化
常用有机溶剂种类
•乙腈、甲醇、丙酮、乙醇、四氢呋喃等
操作实例
50μl 血浆+150μl甲醇 取上清液进样分析
涡旋1min
3500rpm离心10min
有机溶剂沉淀法实例
生物样品种类
均匀生物样品
血液（全血、血浆、血清） 尿液、唾液、胆汁、乳汁、 脑脊液、淋巴液、汗液等
非均匀生物样品
心、肝、肾、脾、肺、脑、 胃、肠、子宫、肌肉、皮 肤等组织、器官
全血
全血
➢全血包括液体成分的血浆和分 散悬浮于其中的血细胞 ➢全血不易保存，且血细胞中含 有很多干扰物质，影响测定， 故较少用全血测定药物浓度。 ➢仅用于血浆药物浓度太低或者 血浆药物浓度波动较大，且难 以控制的药物，如环抱霉素A。
平衡
上样
淋洗
洗脱
基质 杂质 目标化合物
常见的固相萃取柱
➢普通C18固相萃取 •固相萃取材料耐受PH范围窄（2-7.5） •硅胶键合吸附剂的表面存在未键合的硅羟基，对碱性化合 物的保留较强，用硅胶键合吸附剂处理碱性化合物，回收率 通常较低 •对极性化合物保留差
➢HLB(Hydrophilic-lipophilic Balance Copolymer) •PH1-14范围内稳定 •无裸露的硅醇羟基 •亲水物质和亲脂物质具有均衡的保留能力，覆盖了非极性、 弱极性、极性化合物
1、不发生乳化； 2、适应的极性范围较广； 3、提取效率高； 4、方便快速； 5、溶剂用量少； 6、易于自动化； 7、室温下操作，尤其适于处理挥发性及对热不稳定的药物。
目前，商品化固相提取小柱（cartridge）的 应用已比较普遍。
最大的缺点： 贵 20多元/支
三种方法的比较：
样本较干净 基质效应低 操作迅速 适合各种性质化合物
LLE方法操作实例
操作实例
萃取剂
LLE方法操作实例
待测药物：氯雷他定
内标：地西泮
LLE方法总结
优点
➢选择性高，可除去大部分杂质 ➢对有机溶剂蒸发后复溶，可以对样品进行浓缩 ➢样品较干净，对仪器污染小 ➢不同PH体系中与不同的萃取剂组合，可控制回收率，并降 低基质效应