色谱法也叫层析法, 它是一种高效能的物理分离技术, 将它用于分析化学并配合适当的检测手段,就成为色谱分析法。

色谱法的最早应用是用于分离植物色素, 其方法是这样的:在一玻璃管中放入碳酸钙, 将含有植物色素 (植物叶的提取液的石油醚倒入管中。

此时,玻璃管的上端立即出现几种颜色的混合谱带。

然后用纯石油醚冲洗, 随着石油醚的加入, 谱带不断地向下移动,并逐渐分开成几个不同颜色的谱带, 继续冲洗就可分别接得各种颜色的色素, 并可分别进行鉴定。

色谱法也由此而得名。

现在的色谱法早已不局限于色素的分离, 其方法也早已得到了极大的发展, 但其分离的原理仍然是一样的。

我们仍然叫它色谱分析。

一、色谱分离基本原理:由以上方法可知,在色谱法中存在两相, 一相是固定不动的, 我们把它叫做固定相;另一相则不断流过固定相,我们把它叫做流动相。

色谱法的分离原理就是利用待分离的各种物质在两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同来进行分离的。

使用外力使含有样品的流动相(气体、液体通过一固定于柱中或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。

当流动相中携带的混合物流经固定相时, 混合物中的各组分与固定相发生相互作用。

由于混合物中各组分在性质和结构上的差异, 与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同, 随着流动相的移动, 混合物在两相间经过反复多次的分配平衡, 使得各组分被固定相保留的时间不同, 从而按一定次序由固定相中先后流出。

与适当的柱后检测方法结合, 实现混合物中各组分的分离与检测。

二、色谱分类方法:色谱分析法有很多种类,从不同的角度出发可以有不同的分类方法。

从两相的状态分类:色谱法中,流动相可以是气体,也可以是液体,由此可分为气相色谱法(GC 和液相色谱法(LC 。

固定相既可以是固体,也可以是涂在固体上的液体,由此又可将气相色谱法和液相色谱法分为气 -液色谱、气 -固色谱、液 -固色谱、液 -液色气相色谱仪的组成 :载气处理控制系统:专用气源,进入气体恒定; 进样装置:液体样品手动进样:实验室; 气体样品定量管进样:工业色谱柱:分离混合样品组分:填充、毛细管。

吸附 (固、分配 (液检测器和记录仪:热导、电离 2. 定性和定量分析色谱图分析组分物质; 分析组分含量。

基线滞留时间:峰值最大;死时间; 峰高、峰宽、半峰宽; 峰面积、分辨率 3. 定性分析滞留时间法:滞留时间一定, 由此判别组分。

加入纯物质法:加入后分析色谱峰值判别。

4. 定量分析定量进样法:面积归一化法:外标法:智能化GC7890F 气相色谱仪操作规程, 填充柱恒温操作 1. 打开载气高压阀, 调节减压阀至所需压力(载气输入到 GC7890系列气相色谱仪的压力必须在 0.343MPa~0.392MPa ,如果使用氢气为载气时, 输入到气相色谱仪的载气入口压力应为0.343MPa 。

打开净化器上的载气开关阀,用检漏液检漏,保证气密性良好。

调节载气稳流阀载气使流量达到适当值(查 N2或 H2流量输出曲线 7890II 用刻度~流量表 ,通载气 10min 以上。

2. 打开电源开关,根据分析需要设置柱温、进样温度和 FID 检测器的温度(FID 检测器的温度应>100℃。

3. 打开空气、氢气高压阀,调节减压阀至所需压力 (空气输入到 GC7890系列气相色谱仪的压力必须在 0.294MPa ~0.392MPa , 氢气输入到 GC7890系列气相色谱仪的压力必须在 0.196MPa ~ 0.392MPa 。

打开净化器的空气、氢气开关阀, 分别调节空气和氢气针形阀使流量达到适当值 (查空气和 H2流量输出曲线针形阀刻度~流量表。

4. 按[基流 ]键, 观察此时的基流值。

5. 按 [量程 ]键,设置 FID 检测器微电流放大器的量程。

按 [衰减 ]键,设置输出信号的衰减值。

6. 打开 T2000P 色谱工作站点击电脑桌面上图标打开 T2000P 色谱工作站,进入通道 1, 点击【样品项】 ,选择【添加】 ,进入样品项设置界面,点击【新建】按钮,进入【新建一个样品项】的窗口,根据提示完成样品信息和使用方法的设置,并点击【完成】按钮确认,即可完成样品项设置,回到“ 样品项设置==》通道1” 界面,点击【加入】 ,然后点击【关闭】 , 此时界面回到通道 1。

选择刚刚加入的样品项,让其反蓝显示,点击图标(即数据采集开始图标 ,色谱工作站开始走基线。

7. 待 FID 检测器的温度升高到 100℃以上,按 [点火 ]键, 点燃 FID 检测器的火焰。

8. 点火后再观察基流值,如果此时基流显示值大于原来的显示值 , 说明 FID 的火焰已点燃 (色谱工作站上基线急剧上升后将回到高于点火前基线的位置。

9. 进样分析点火后让基线走一段时间,平稳后点击色谱工作站上■ 图标(即数据采集结束图标 ,停止走基线,色谱工作站处于等待状态,用微量进样器进样,同时按下信号遥感器, 色谱工作站开始数据采集。

待峰出完后,点击■ 图标,停止数据采集。

在停止采集后,可以在通道 1界面“ 已完成进样” 这里找到刚刚采集的谱图名, 让其反蓝显示, 然后点击按钮, 进入“ 再处理” 界面;点击按钮,进入“ 报告预览” 界面;在这两个界面下,都可以看到需要的信息,如保留时间,峰面积等。

10. 关机时,先关闭高效净化器的氢气和空气开关阀,以切断 FID 检测器的燃气和助燃气将火焰熄灭。

然后设置柱箱、检测器、进样器的温度至 30℃, 气相色谱仪开始降温,在柱箱温度低于 80℃以下才能关闭电源,最后再关闭载气。

气 -质联用 GC/MS被广泛应用于复杂组分的分离与鉴定 ,其具有 GC 的高分辨率和质谱的高灵敏度,是生物样品中药物与代谢物定性定量的有效工具。

质谱仪的基本部件有:离子源、滤质器、检测器三部分组成,它们被安放在真空总管道内。

接口:由 GC 出来的样品通过接口进入到质谱仪,接口是色质联用系统的关键。

l 接口作用:l 压力匹配——质谱离子源的真空度在 10-3Pa ,而 GC 色谱柱出口压力高达 105Pa ,接口的作用就是要使两者压力匹配。

l 组分浓缩——从 GC 色谱柱流出的气体中有大量载气,接口的作用是排除载气, 使被测物浓缩后进入离子源。

常见接口技术有:l 分子分离器连接 (主要用于填充柱 l 扩散型——扩散速率与物质分子量的平方成反比, 与其分压成正比。

当色谱流出物经过分离器时, 小分子的载气易从微孔中扩散出去,被真空泵抽除,而被测物分子量大,不易扩散则得到浓缩。

l 直接连接法(主要用于毛细管柱 l 在色谱柱和离子源之间用长约 50cm ,内径 0.5mm 的不锈钢毛细管连接,色谱流出物经过毛细管全部进入离子源,这种接口技术样品利用率高。

l 开口分流连接 l 该接口是放空一部分色谱流出物,让另一部分进入质谱仪, 通过不断流入清洗氦气, 将多余流出物带走。

此法样品利用率低。

离子源离子源的作用是接受样品产生离子,常用的离子化方式有:l 电子轰击离子化(electron impact ionization, EI lEI 是最常用的一种离子源,有机分子被一束电子流(能量一般为 70eV 轰击,失去一个外层电子,形成带正电荷的分子离子(M+ , M+进一步碎裂成各种碎片离子、中性离子或游离基,在电场作用下,正离子被加速、聚焦、进入质量分析器分析。

lEI 特点:l 电离效率高,能量分散小,结构简单,操作方便。

l 图谱具有特征性,化合物分子碎裂大,能提供较多信息, 对化合物的鉴别和结构解析十分有利。

l 所得分子离子峰不强, 有时不能识别。

l 本法不适合于高分子量和热不稳定的化合物。

l 化学离子化(chemical ionization , CI l 将反应气(甲烷、异丁烷、氨气等与样品按一定比例混合,然后进行电子轰击,甲烷分子先被电离,形成一次、二次离子,这些离子再与样品分子发生反应,形成比样品分子大一个质量数的 (M+1 离子, 或称为准分子离子。

准分子离子也可能失去一个 H2 , 形成 (M-1 离子。

lCI 特点 l 不会发生象 EI 中那么强的能量交换,较少发生化学键断裂,谱形简单。

l 分子离子峰弱,但(M+1 峰强,这提供了分子量信息。

场致离子化(field ionization, FI l 适用于易变分子的离子化,如碳水化合物、氨基酸、多肽、抗生素、苯丙胺类等。

能产生较强的分子离子峰和准分子离子峰。

场解吸离子化(field desorption ionization, FD l 用于极性大、难气化、对热不稳定的化合物。

负离子化学离子化(negative ion chemical ionization , NICI l 是在正离子 MS 的基础上发展起来的一种离子化方法, 其给出特征的负离子峰,具有很高的灵敏度(10-15 g 。

质量分析器其作用是将电离室中生成的离子按质荷比(m/z大小分开,进行质谱检测。

常见质量分析器有 l 四极质量分析器(quadrupole analyzer l 原理:由四根平行圆柱形电极组成,电极分为两组,分别加上直流电压和一定频率的交流电压。

样品离子沿电极间轴向进入电场后, 在极性相反的电极间振荡, 只有质荷比在某个范围的离子才能通过四极杆, 到达检测器, 其余离子因振幅过大与电极碰撞, 放电中和后被抽走。

因此,改变电压或频率, 可使不同质荷比的离子依次到达检测器, 被分离检测。

扇形质量分析器 l 磁式扇形质量分析器(magnetic-sector mass analyzer l 被电场加速的离子进入磁场后,运动轨道弯曲了,离子轨道偏转可用公式表示:l l当 H , V 一定时, 只有某一质荷比的离子能通过狭缝到达检测器。

l 特点:分辨率低,对质量同、能量不同的离子分辨较困难。

l 双聚焦质量分析器(double-focusing mass assay l 由一个静电分析器和一个磁分析器组成, 静电分析器允许有某个能量的离子通过, 并按不同能量聚焦, 先后进入磁分析器,经过两次聚焦,大大提高了分辨率。

l 离子阱检测器(ion trap detector l 原理类似于四极分析器,但让离子贮存于井中,改变电极电压,使离子向上、下两端运动,通过底端小孔进入检测器。

检测器检测器的作用是将离子束转变成电信号,并将信号放大, 常用检测器是电子倍增器。

当离子撞击到检测器时引起倍增器电极表面喷射出一些电子, 被喷射出的电子由于电位差被加速射向第二个倍增器电极, 喷射出更多的电子, 由此连续作用, 每个电子碰撞下一个电极时能喷射出 2-3个电子,通常电子倍增器有 14级倍增器电极,可大大提高检测灵敏度。

GC-MS 的常用测定方法 l 总离子流色谱法(total ionization chromatography , TIC ——类似于 GC 图谱,用于定量。