基因指纹技术的原理及其应用
Wyrnan等人首先在人基因文库的DNA随机片段中, 分离出高度多态的重复顺序区域, 此后, Ben等在人胰岛素基因附近, Higgs等在α--珠蛋白基因附近等发现有高度重复序列, 有人把这些分散在基因组的串联重复的短小序列称为小卫星DNA (Minisatellite DNA )。
一个小卫星DNA重复单位长度一般从几个到几十个核苷酸, 重复单位数目从几个到几百个。
不同的重复单位数目构成了小卫星D N A的高度多态性。
Jeffreys等(1985a)用人的肌红蛋白基因内含子高变区重复序列的核心序列作为探针, 在不十分严格的洗脱条件下同 D N A 内切酶酶切的人基因组DNA的电泳图谱进行southern印迹杂交, 所产生的图谱在不同个体之间均存在明显差异性, 与人的指纹相似, 表现出高度的个体特异性. 这种特异性仍按孟德尔方式遗传,因而称为DNA指纹图谱。
继小卫星D N A之后, 另一类更简单的短序列核苷酸串联重复亦被发现, 重复序列的核苷酸核苷酸数目可能是1个, 2 个或3个、4个, 其中最常见的双核苷酸, 即(A C )n和(T G )n (n 大约1 0---6 0 ) , 这被称为微卫星D N A (Mierosatellite DNA ) 。
在人类基因组中存在5000 ---10000 个这类串联重复家族,因而列为最丰富时穿插重复D N A 家族之一, 它均匀地穿插在基因组中.Ali等( 1987) 用人工合成的寡核苷酸多聚体作探针, 也得到了人的DNA图普。
Welsh 等(1990)和Williams等(1990)用任意寡核苷酸作引物对基因组进行PCR扩增, 扩增产物的电泳图谱也表现高度的变异性, 这就是随机放
大多态DNA分析(RAPD ) , 也算是一种DNA指纹分析。
基于RFLP基础上的D N A 指纹技术一都般包括以下几个步骤：先将被检测的生物样得到广泛应用。
品中的D N A 提取出来, 电泳检测D N A 的质与量, 看D N A 是否降解。
如果降解, 则用与探针配对使用的限制性内切酶酶切, 电泳, 再用Southern印迹法转移到尼龙膜上, 最后用放射性同位素标记的D N A 探针与转到尼龙膜上的D N A 杂交,X 射线使胶片曝光后, 即得到长度不同的D N A 片段的显影, 即是D N A指纹图谱。
但是如果D N A 样品少, 且有降解, 则用PC R 技术扩增, 同样可得到D N A 指纹图谱。
一、D N A 指纹具有下述儿个特点:
第一, 不象传统的R FLP 一个探针只检测一个特异性位点的变异性, 而一个D N A 指纹探针一次就能同时检测十JL: 个, 甚至几十个位点的变异性, 因而D N A 指纹更能反映基因组的变异性。
D N A 指纹中的谱带大部份来源于随机分布在基因组上的高变异位点, 同一图谱中呈紧密连锁遗传的带所占比例极少, 所以一个D N A指纹能同时提供10 多个独立的遗传标记。
第二, 具有高度的变异性。
由于D N A 指纹谱是由众多高变位点上的等位基因形成, 因而具有很高的变异性。
Je ff r e y等对人的DNA指纹的研究表明, 大部分谱带都以杂合状态存在,平均杂合率大于70帕, 某些大片段的杂合率甚至高达10肠。
据估算探针33.15产生的人的指纹, 两个随机个体具有相同D N A 指纹谱的概率仅为3 x l0-11。
可见其具高度的个体特异性。
只有同卵双生子女才会有完全相同的D N A 指纹谱。
第三, 具有简单
的稳定的遗传性。
Jeffrey通过家系分析表明, DNA指纹谱中几乎每一条带都能在其双亲之一的谱中找到, 而产生新带的概率仅在0.0 1 ~ 0 . 0 04之间。
D NA 指纹的杂合带符合孟德尔遗传规律, 双亲的每条杂合带平均传递给50 肠的子代。
第四,D N A 指纹谱还有体细胞稳定性,即从同一个体中不同组织如血液、肌肉、毛发、精液等产生的D N A指纹完全一致。
两个最早的D N A 指纹探针是Je ff r o y s 及其同事所发现的人源多核心小卫星探针3 3 . 6 和3.15 后研究发现,33. 6 和33.15 能广泛地适用于许多种类的动物和一些种类的植物D N A 指纹分析。
二、DNA指纹的应用
1. 法医学方面
由于D N A 指纹具有上述特点, 使其成为法医学上鉴别罪犯, 亲子鉴定和确定个体间亲缘关系的工具。
如我国公安部利用D N A指纹已侦破数百例疑难案件。
同时也可用于亲子鉴定方面，由于D N A 指纹图具有高度的个体特异性, 它是通过比较孩子、母亲及被控父亲的D N A 指纹图, 达到亲子鉴定的目的。
如果子代D N A 指纹图上的所有谱带均可在其双亲找到来源, 孩子与被控父亲的D N A 指纹图有共同谱带5 条以上, 可肯定亲子关系; 反之, 若子代D N A 指纹图上有三条以上谱带不能在其双亲找到来源则可否定亲子关系。
2 . 连锁分析
鉴于小卫星区域所具有的上述特点, 使它同一般的RFLP 相比较所体现的优越性, 使其在人类遗传学的各个研究领域具有较高
的应用价值。
Jeffrey研究了一个由1个同胞组成的多发性神经纤维瘤病家系, 发现该家系几乎全部可辨认的片段都以杂合状态存在; 且仅传递给部份后代。
通过该家系中所有父亲或母亲D N A 片段分离型的配对比较, 鉴别出了连锁基因对和等位基因对, 探针3 3 .6 在父母双方各检出了一个连锁基因对, 33.6和33.5 巧两个探针检出的D N A 片段没有一个是相同的, 而且二者的片段也不存在连锁关系。
分析表明, 可辨认的小卫星位点散布在人基因组中的大部份区域上, 有一个来源子受累母亲的小卫星片段被证明同多发性神经纤维瘤病相连锁。
3 . 遗传病的早期诊断
用小卫星D N A 诊断遗传性疾病过程为: 在基因内或基因附近寻找小卫星D N A , 制备探针或引物, 经连锁分析确定最佳条件或Pc R直接扩增, 对致病基因具体情况不太清楚时, 可利用步移, 逐步克隆致病基因, 然后作序列分析, 由于小卫星DNA分布很广, 总能找到理想的标记。
据计算, 20 种小卫星探针就可定位3 x l09b p 的人基因组, 探针与基因真实位点不超过4.0cM。
Huntington病为常见的遗传病, 发现D4s95位点与基因密切连锁, 该位点内含一小卫星区, 现已将区域制为探针, 以此可进行家系诊断及致病基因的克隆研究.
4. 肿瘤的研究
肿瘤是多因素, 多阶段的变化过移, 涉及多个癌基因和肿瘤抑制基因。
其病因复杂, 变化多样, 但归根结底还是在DNA的变化上。
有些变化可用小卫星探针检测, 一般说来, 癌组织, 转移灶与正常组织或外周血细胞D N A指纹有差别, 常见的是某条带或儿条带的缺失,
某一条或某几条带密度降低, 或者癌组织中出现新的带。
Y asukir 等用33. 6 和33.15 探针检查了患不同肿瘤病人正常组织, 外周血、癌组织的DNA指纹, 用33. 6探针, 正常组织和癌组织指纹69 肠有差异, 用3 3 .15 则为5 肠。
在4 个转移癌病人中3 人的D N A 指纹与原发灶不同。
T a k a d 等也发现在9 例转移瘤病人中有5 例出现新带, 说明癌细胞遗传上不稳定。
5. 人类基因定位
人类基因定位中最主要的工具是DNA标记, 而任何一个双态性标记, 对50%左右的连锁分析, 不能提供任何线索, 给基因定位带来很大困难。
Nakamura等用已知的小卫星顺序作探针, 从人基因质粒文库中, 筛选出许多小卫星基因, 确定了7 个基因座位的等位基因数目、长度变异和杂合性比率。
其中有1 个基因座位等位基因数目大于10 个, 杂合率85 ~91%, 然后用单位点探针与基因组DNA 杂交,及与D N A 指纹谱不同的单位点杂交图, 高度的杂合性使95%以上的个体都呈现出不同长度的两条带。
这种基因座位的小卫星DNA标记在基因定位与基因作图中具有独特的优越性。
6、细胞系鉴定
据估计, 实验室中细胞系的污染机会占30%, 因此对细胞系的鉴定显得非常重要。
目前鉴定细胞系的方法有同工酶分析, 细胞遗传学分析。
前者所检查的基因座位少, 而后者可立刻检查到典型的变化, 但不稳定性使其信息有限。
由于两个随机个体具有相同DNA指纹的概率为3 x10-11。
因此可将D N A 指纹技术用于细胞系鉴定。
多位点
的DNA 指纹探针可同时提供基因组上许多墓因座位的情祝和检查微小的或散在的遗传变化, 因而可对来自同一个体的细胞索进行分类和对突,变体进行识别。
目前越来越多的火利用单位点探针在高严谨的条件下进行杂交, 在细胞系鉴定上很有用。
最近有人结合PCR 进行DNA指纹分析,能对southern 杂交不能检测到的微小变化进行基因座位分析.目前这三种方法都在ECACC使用, 其中D N A 指纹分析可检查细胞的变化, 且能很快筛选。
而细胞遗传分析只有在标记有染色体约情况下才能进行。
综合以上可以看出DNA指纹作为基因组中的高度多态遗传标记, 能够按照孟德尔方式等显性地遗传, 具有组织细胞稳定性, 又有高度的个体特异性, 含多态信息量很丰富, 是一种很有用的遗传标记。
但是, 在实际应用中, D N A 指纹图谱中的谱带较多, 而且各条带的强弱不一, 不易判读, 对等位基因的判断也较为困难。
目前, 多位点探针检测D N A 片段的范围通常在4至2 4 kb之间, 小于4k b 的基因组酶切片段可能很有意义. 但是不能判读.。