185g
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CCME 03
测序引物问题：
现象：每个峰后面有个同样荧 光信号的小“尾巴”。 原因：合成是引物多一个碱基。 对策：重新合成引物。
现象：每个峰前面有个同样荧光 信号的小“尾巴”。 原因：合成时引物少一个碱基。 对策：重新合成引物。
引物或模板不纯：
现象：整个峰图噪音都比较高； 原因：引物或模板不纯； 对策：选用高纯度的引物，或模版纯化要充分。
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解决方案：1、检测模板浓度 及纯度；2、减少反应体积优 于提高模 板稀释度；3、检测 引物浓度是否 正确；4、检测 是否有不易测通的 区域存在。
CCME 03
测序结果背景高并且信号值低(<150)
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原因： 1、部分测序反应失败；2、模板量太多或太少； 3、 测序反应后纯化丢失了部分样品；
加样时注意事项：
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4. 加样使用的枪头在枪头盒中的位置对应测序反应 板每个孔的位置；每加完一种试剂后都要在黑色 背景上检查，有少加或漏加情况时应立即补足， 确认无误后方可进行下一步操作；
5. 加错试剂时立即在测序反应表中记录，在新的板 孔中重新加样；
6. 加不同试剂或相同试剂加入含有不同试剂的板孔 中，必需换枪头；
上PCR仪注意事项：
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1.上机前确认样品板的孔都加了样品；
2.确认PCR程序是否正常终止；
3.程序结束后，观察每孔是否有蒸干现象；
4.连续使用PCR仪时，两轮之间让机器待机20 分钟以上。
测序检测所用的3730XL
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CCME 03
测序峰图的简单分析
我们所用的峰图分析软件为： Sequence Scanner V 1.0
• SBT法HLA高分辨分型已逐步在欧美国家 推广，并成为“金标准”。目前我们华大 也以SBT法为主，并结合SSP方法进行HLA 的配型。
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CCME 03
HLA的介绍
back
PCR-SBT法分型的基本流程
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CCME 03
测序原理
双脱氧链终止法（Sanger法）：
1977年，英国人Fred Sanger 发现，如果在DNA复 制过程中掺入ddNTP，就会产生一系列末端终止的 DNA链，并能通过电泳按长度分辨。不同末端终止 DNA链的长度是由掺入到新合成链上随机位置的dd NTP决定的。
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4
CCME 03
HLA的介绍
HLA分型
1、血清学分型 2、细胞学分型 3、DNA分型
①PCR-RFLP技术 ②PCR-SSO技术 ③PCR-SSP技术 ④PCR-SBT技术
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CCME 03
HLA的介绍
• PCR-SBT: 以PCR扩增所要分析的基因片断 ，然后对DNA序列进行分析，可以直接得 到基因型。分辨率高，可大规模进行，精 确度高，能直接发现新的等位基因。
上PCR仪：
1. 短暂离心后上PCR仪。
2. 测序反应程序： 96℃，2min→｛96℃，10s→55℃，
5s→60℃，2min｝×25cycles→15℃，∞；
3. PCR仪程序运行结束后冷却到15℃，退出程序， 取下测序反应板，记录PCR仪运行情况；在纯化板 左边画上“√”代表已上PCR仪；冰箱冷藏区特定位 置保存，待纯化，并通知纯化岗同事。
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13 CCME 03
测序反应实验前准备
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• 预约PCR仪 • 编写测序反应表 • 根据要检测的样品数计算试剂的需要量 • 查看实验所需的耗材是否够用 • 用70％乙醇擦桌面，不能残留粉尘
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CCME 03
Mix配制
Step1：按实验需要的体系和用量计算各组分的加量， 冰上或4℃避光缓慢解冻2.5×BigDye；
Mix配制注意事项
back
①对多个使用相同引物的测序反应可以把引物加到 mix中
②配制mix和稀释引物的millipore水应分别使用； ③吸取不同的试剂要换枪头； ④试剂打开后应立即吸取并盖好盖子，接触样品的
容器、试剂严禁长时间暴露在空气中，时刻防止 污染！
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17 CCME 03
引物稀释
Sanger法测序
--在HLA-SBT分型中应用
杨华志 唐金凤 胡志锋 周巧云 杨晓琴 2009.10
目录
• HLA的介绍 • 测序原理—Sanger法测序 • 测序反应操作流程及注意事项 • 简单的峰图分析
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CCME 03
HLA的介绍
第3页
3
CCME 03
HLA的介绍
为什么要进行HLA检测
CCME 03
引物稀释
液体稀释： 根据以下公式计算（通常使用液浓度＝3.2pmol/μL）
加水量=(储存液体积×储存液浓度/使用液浓度)-储存 液体积
按预算的体积在1.5mL离心管中加入millipore水， 吸取所需体积的指定引物储存液加入水中，充分振 荡30秒，离心10秒，备用。
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CCME 03
CCME 03
POLY结构对信号的影响：
Poly在序列的 前端对信号影 响较小
Poly在序列的 后端对信 号影响较大
Poly-G/poly-C很容易导致信号中断和信号乱：
back
Thank you!
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CCME 03
整板峰图的大概情况：
原始数据Raw窗口：
无反应
原因：1、模板质量差；2、模板浓 度过高或者过低；3、纯化时样 品 丢失；4、引物降解或者加错； 5、 Bigdye浓度过低或者失效；6、 水 污染；7、PCR仪温度不稳定
解决方案：1、检测模板纯度； 2、调节模板浓度；3、换新的 引物；4、 提高Bigdye浓度； 5、换水；6、检 测PCR仪；7、 保证纯化时酒精的浓 度及体 积，倒甩时速度不能高于
稀释引物注意事项
back
1、引物稀释前要离心，液体引物12000rpm 离 心30s,干粉引物12000rpm离心2min。
2 、打开干粉引物离心管盖时动作尽量轻缓， 打开的角度不超过45°。
3、每次稀释引物前，均需用新的millipore水。 4、加水稀释时注意枪头的更换，避免交叉污
染。 5、稀释完后，将引物的流水号和引物名称一
第11页模板的序列。
CCME 03
测序原理 PCR与测序反应的比较
PCR
DNA 聚合酶 Taq酶
引物
一对
底物
dNTP
模板
量少
产物
等长的DNA片段
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back
测序反应
测序酶 单向
dNTP+ddNTP* 质量要求高
长短不一的片段 3’端带荧光标记
CCME 03
测序反应操作步骤
• 实验前准备 • Mix配制 • 测序引物稀释 • 编板号（日期_S位点_测序引物_纯化板编号_（其它）） • 反应加样 • 短暂离心后上PCR仪
5×buffer
0.85 μL
Primer（3.2p） 1.0 μL
去离子水
1.85 μL
-------------------------------------
5μL
DR位点用1/20体系
1/20体系：
模板
1.0 μL
Bigdye（2.5×）
0.4μL
5×buffer
0.8μL
Primer（3.2p）
PCR产物20-50ng；质粒100-200ng
3.2pmol
0.5μl
0.4μl 0.3μl 0.2μl
0.75μl 0.8μl 0.85μl 0.9μl
5μl
Step2：振荡3秒或颠倒5次混匀，离心10秒，冰上或 4℃避光保存，当天使用；剩余mix可-20℃保存，避 免反复冻融，解冻2次内用完。
• HLA 是迄今为止发现的多态性最高的基因系统 之一，它与同种异体器官移植的排斥反应密切 相关，而且该基因的高度多态性在法医学上的 亲子鉴定、个人识别以及疾病相关性和人类进 化研究方面也起着重要作用。
• HLA配型在器官移植中是必要的。HLA的相容 性程度（配型的符合程度）是决定移植物长期 存活的主要因素之一。
干粉稀释 Step1：按合成报告单上的分装规格计算稀释至所需浓
度应加入的超纯水； Step2：将干粉离心12000rpm， 2min； Step3：加入一定体积的millipore水后盖好离心管盖； Step4：振荡1分钟，室温放置30分钟，使其充分溶解； Step5：再次振荡30秒，离心10秒。

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1.0 μL
去离子水
1.8μL
--------------------------------------------
5μL
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21 CCME 03
加样时注意事项：
1. 使用前检查移液器量程设定是否准确； 2. 使用时检查吸取液体量是否准确，排液后枪头内 不能有残留； 3. 在距管口3-5毫米处贴管壁加微量试剂.
N
H H
OH
H H
OH （ H）
OH（H）
OH OH（H）
脱氧核糖核苷酸通过形成3,5-磷酸二酯键延长DNA链
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CCME 03
测序原理
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10 CCME 03
测序原理
经PCR扩增反应，可以得到一系列长度不同的产物，由于ddNTP带有荧
光标记，对产物进行电泳分离，并用相应的仪器进行检测，就可以读出
一对应写在新的Ep管上。
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CCME 03
反应加样
• 按《测序反应表》将待测样本和测序引物摆放到 96试管架上对应位置；移液器调至所需量程；实 验用品放在便于操作的位置；测序反应板标记板 号后开始加样。