SYBR Green I作用机理
数量关系
1. 每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去 2. 染料一结合，就产生荧光信号 3. 信号强度与DNA分子总数目成正比
TaqMan探针的FRET
E
TaqMan® Probe R
E
Q
E
R
E
Q
TaqMan作用机理
数量关系
上游引物
3’ 5’
3’ 5’
线性图谱
对数图谱
基线 阈值 Ct值 [DNA]0
什么是阈值？
1. 基线（空白）信号的产生是由于测量的偶然误差引起的。 2. 偶然误差的结果满足对数分布。 3. 阈值 = 基线（背景）信号标准偏差 x 10。 4. 由于测量的偶然误差而导致测得的荧光信号大于阈值的概率小于10－5。 5. 当荧光信号大于阈值时，可以肯定是由于PCR的扩增使得荧光强度得以测量。
实实时时PPCCRR分分析析
绝绝对对定定量量
相相对对定定量量
根据标准曲线 提供数量测量
提供精确的起始材料 相对数量差异
绝对定量与相对定量的定义
• 绝对定量分析用于确定未知样本中某个核酸序列的绝对量值，即通常 所说的拷贝数。
• 相对定量用于测定一个测试样本中目标核酸序列与校正样本中同一序 列表达的相对变化。校正样本可以是一个未经处理的对照或者是在一 个时程研究中处于零时的样本。
T=24hr
IL-2 18S ΔCt 24 9 15 24 10 14 23 11 12
28 10 18
ΔΔCt 0 -1 -3
3
2-ΔΔCt 1.0 2.0 8.0
0.1
Relative Quantity of Expression
10
8.0
8
6
4
2.0
2
1
0.1
0
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
t=0 t=1h t=6h t = 24 h
相对定量研究软件
• 同时分析多达10块反应板的基因表达数据 – 多至960个数据点的单击分析 – 数据直观
• 通过ΔΔCT (比较 Ct)法完全自动分析数据 • 无须将数据导出至电子数据表或多次数据导出
终终点点检检测测
等等位位基基因因分分型型
阴阴性性阳阳性性鉴鉴定定
突变的存在形式
目标序列的有无
等位基因分型
基线 阈值 Ct值 [DNA]0
什么是CT值？
从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数
线性图谱
对数图谱
CT值
CT值
为什么CT值 ∝ [DNA]0 ？
N = N0 x (1+e)n
N：产物分子数；N0：起始分子数 e： 扩增效率； n: 循环次数
PCR理论方程只在指数期成立
线性期
lg [DNA]
指数期 y = x(1+e)n
TaqMan 探针
R
Q
5’
3’
下游引物
R
Q
5’
3’
1. 每产生一条DNA链，就切断一条探针
2. 每切断一条探针，就产生一个单位信号
3. 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比
Real-time PCR 应用
• 绝对定量(Absolute Quantification，AQ)
• 病原体检测 • 转基因食品检测 • 基因表达研究
基线 阈值 Ct值 [DNA]0
由于PCR扩增效率的差异使得相同的样品 扩增结果存在很大的差异
同时扩增96的相同样品的结果
线性图谱
扩增曲线：四个阶段
平台期
线性增长期 指数增长期 基线期
平台期 线性增长期 指数增长期
基线期
对数图谱
基线 阈值 Ct值
什么是基线？
基线就是扩增曲线中的水平部分。
[DNA]0
cDNA cDNA
cDNA cDNA
相对定量：内对照 Endogenous Control
用以标准化样品操作
time
t =0
t=12
t=24
t=48
total RNA total RNA total RNA total RNA
cDNA cDNA
cDNA cDNA
T=0 (calibrator) T=1hr T=6hr
Real-time PCR
Xiao Jin Applied Specialist Molecular & Cellular Biology
Real-time PCR 原理
数学原理 化学原理
Real-time PCR 应用
绝对定量 相对定量 等位基因分型 阴阳性判定 microRNA
荧光定量PCR数学原理
循环数
为什么CT值 ∝ [DNA]0 ？
Rn = RB + X0 (1+ e)n Rs
第n次PCR循环时的荧光信号强度(Rn)等于背景信号强度(RB)加上每个分 子的荧光强度(即单位荧光强度，RS)与分子数目的乘积。
设n=CT，则：
RCT = RB + X0 (1+ e)CT Rs lg (RCT - RB) = lg X0 + CT lg (1+ e) + lg Rs CT lg (1+ e) = - lg X0 + lg (RCT - RB) – lg Rs
CT
= − log X O log(1 + E X )
+
log(RT − RB ) − log RS log(1 + EX )
即 CT = - k lg X0 + b （线性方程）
标准曲线：CT值对[DNA]0作图
CT值
CT = - k lgX0 + b
lg [起始DNA]
成功的定量PCR
荧光定量PCR化学原理
• 定义：等位基因分型(AD)分析是一种多重（每个反应包括一个以上的 引物和探针对）、终点（在PCR过程的终点收集数据）分析实验，用 于检测某个核酸序列的变异。
• 每个反应中包括两个引物和探针对，允许在一个目标模板序列的单核 苷酸多态性（SNP）位点上出现两个可能的变异基因型。
绝对定量：从荧光到拷贝数
The well contains 400 target copies
Y= mx+b
Ct‘s
Ct values
0
1
2
3
4
5
6
7
Log copy number
相对定量：参照因子 Calibrator
用以比较结果的基准
time
t =0
t=12
t=24
t=48
total RNA total RNA total RNA total RNA
• 相对定量(Relative Quantification，RQ)
• 基因在不同组织中的表达差异 • 药物疗效考核 • 耐药性研究
• 等位基因分型(Allelic Discrimination，AD)
• 基因突变分析 • SNP研究 • 物种鉴定、菌株鉴定
• 阴性阳性鉴定(Plus/Minus with IPC，+/-)