酶学糖化酶的研究进展2013年糖化酶的研究进展摘要:糖化酶是世界上生产量最大和应用X围最广的酶制剂,在工业中具有重要的应用价值。

本文从微观学角度出发，主要介绍了糖化酶的结构和催化作用机制；另外介绍了糖化酶的分离纯化手段及其功能应用；最后提出了研究中存在的问题以及解决办法，并对糖化酶应用研究的前景进行了展望。

关键词：糖化酶；结构；催化机制；分离纯化；功能STUDYING STRUCTURE AND FUNCTION OFGLUCOAMYLASEAbstract:Glucoamylase is the enzyme which has the most output and the vastest application in the world . From the perspective of microscopic science, This review introduces the structure and catalytic mechanism of glucoamylase; additionally introduced separation and purification methods and application of glucoamylase; In the end, put forward the application, the problems and solutions of glucoamylase research, provide future application prospect.Keywords: glucoamylase；structure ；Catalytic mechanism；Purification；function 糖化酶又称为葡萄糖淀粉酶(glucoamylase),全称是α-（1-4）-葡聚糖—葡萄糖水解酶，它的底物是葡萄糖分子通过α-（1-4）-糖苷键连成的高分子，水解产物是葡萄糖，酶学编号是E3.2.1.3[1]。

糖化酶是淀粉转化为葡萄糖过程的主要酶类，早在1500年前，我国已用糖化曲酿酒，本世纪20年代法国人卡尔美脱才在越南研究我国小曲, 并用于酒精生产。

目前，糖化酶已涉及到食品、医学、发酵等多个行业，具有广泛的应用价值。

1．糖化酶的结构及其催化机制1.1糖化酶的结构糖化酶是由微生物分泌产生的，具有外切酶活性的胞外酶，催化淀粉从非还原端水解α-1，4糖苷键逐个释放出单个β-D-葡萄糖。

它是一种含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的糖蛋白, 分子量在60000～1000000间，含有一个催化域(CD)和一个淀粉结合域(SBD)，两者之间通过O-糖基化连接域(L)连接起来[2]。

糖化酶的N末端催化区域通过( α/α)形成一个漏斗状活性中心，经高度糖基化的O-糖基化连接域与C末端通6过β反平行折叠形成的两个淀粉亲和区相连接，在空间上具有相对紧密、稳定活性功能。

糖化酶催化域（CD）含有400多个氨基酸残基，富含Ser和Ala两种氨基酸，其中ser443和ser444之间热稳定性较差，易断裂。

来自不同真菌的糖化酶的催化域的二级结构有所差异。

泡盛曲霉X100的糖化酶CD中含有13股α一螺旋，除α一螺旋11外均参与折叠成“桶”状(α/α)结构，黑曲霉及子囊菌酵母糖化酶CD的构型与泡盛曲霉X1006的CD构型基本相似，但子囊菌酵母CD含有14股α一螺旋，其中的12股α一螺旋形成与泡盛曲霉、黑曲霉CD结构类似。

Sauer等人认为黑曲霉糖化酶水解α一1，4--糖苷键的机制是典型的酸碱催化，Glu179和Glu400分别为催化中心的质子供体和质子受体，Glu179提供的质子传递给淀粉链中易断裂键的糖苷键上，形成含氧碳正离子，在Glu400协助下接受水的亲核攻击而使糖苷键断裂，同时使水解产生的α—D(+)-葡萄糖异构化生成β一D(+)构型[3]。

淀粉结合域(SBD)的结构中，根据SBDs氨基酸序列的同源性，SBDs被划分为6族，分别为CBM20、CBM21、CBM25、CBM26、CBM34和CBM41，黑曲霉和米根霉分泌的糖化酶分别属于CBM20和CBM21。

来源于黑曲霉的糖化酶(AnGA)的SBD位于AnGA的C一末端，而来源于米根霉的糖化酶(RoGA)不仅C 一末端含有一个SBD．且N一末端也含有一个SBD。

AnGACBM20和RoGACBM21约含100个氨基酸，其中富含苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸（Tyr)和色氨酸(Trp)等芳香族氨基酸残基，不含半胱氨酸(Cys)。

AnGACBM20和RuGACBM21两者之间的氨基酸序列差异很大，同源性仅为13．5％，但芳香族氨基酸的同源性较高，主要为色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。

虽然两者氨基酸序列同源性很低，但其二级结构和三级结构却惊人的相似。

两者均不含α一螺旋结构，仅含β一折链和无规卷曲结构，由7~8段β一折叠链反平行折叠形成β一卷筒，β一卷筒再折叠形成2个β一折叠结构，两个底物亲和位点(S l和SII)分别位于结构域的相向两侧。

S I和sⅡ中分别含有一个色氨酸(W)残基，AnGACBM20的SI含W590，S II含W563，Ro—GACBM21的SI 含W70，SⅡ含W47；CBM表面分布着较丰富的酪氨酸残基(Y)，RoGACBM21含有6个Y 残基(Y32、Y58、Y67、Y83、Y93和Y94，AnGACBM20含2个Y残基Y527和Y556。

SBD不仅具有结合淀粉、多聚糖及寡聚糖等碳水化合物的功能还具有协同催化域水解底物的生物活性。

AnGACBM20和RoGACBM21的S I、SⅡ都能结合淀粉颗粒，但两者对底物的亲和性差异较大，sⅡ亲和力(Kd=6.4µM)远大于SI(Kd=28µM)。

S I主要是在催化反应起始阶段识别底物，它只能识别可溶性长链多聚糖，同时还具有促进SⅡ对底物的亲和作用；SⅡ则引起底物的构像改变，以淀粉类似物β一环糊精(BCD)为底物，发现β-CD的非极性面结合到SBD的特定氨基酸的芳香环上。

正常情况下，淀粉颗粒中的淀粉链之间是相互平行呈线性，而结合在SBD的2个位点上的2条淀粉链的方向几乎是相互垂直。

由此可以推断，SBD诱导淀粉链形成2个β转角，扭转了淀粉链的方向,使更多的底物向催化域中心靠近，产生底物‘定向效应’从而促进结合位点的亲和作用,提高酶的反应速率[4]。

O一糖基化连接域是一段约含70个氨基酸经高度糖基化的多肽链，糖质量分数约为70％，不同生物来源的糖化酶含O一糖基化连接域的比例不同，可变性较大。

该区域富含Ser和Thr残基，研究发现ser和Thr位点是寡聚糖O一糖基化的糖基化位点，且在生物活性条件下，甘露糖比半乳糖更容易以O一糖苷键连接到连接域的Ser和Thr 残基上，平均每个Ser和Thr残基上连有5个甘露糖。

在糖化酶结构中，O一糖基连接域起连接催化域(CD)和淀粉结合域(SBD)的作用。

O一糖基连接域与低聚糖以共价键结合，对蛋白质骨架起到固定化作用，从而避免糖化酶被蛋白酶水解，而它本身不具有增强糖化酶亲和力的作用。

此外，该结构域还具增强糖化酶热稳定性的作用。

1.2糖化酶的催化机制糖化酶催化域含有400多个氨基酸残基，富含Ser和Ala两种氨基酸，其中Ser443和Ser444之间热稳定性较差，易断裂。

Sauer 等人研究了黑曲霉糖化酶，认为其催化水解α-1,4-糖苷键是典型的酸碱催化[3]。

Glu179和Glu400分别为催化中心的质子供体和质子受体，Glu179提供的质子传递给淀粉链中易断裂键的糖苷键上，形成含氧碳正离子，在Glu400协助下接受水的亲核攻击而使糖苷键断裂，同时使水解产生的α-D(+)-葡萄糖异构化生成β-D(+)构型。

糖化酶的底物具有特异性，糖化酶对底物的水解速率不仅取决于酶的分子结构, 同时也受到底物结构及大小的影响。

许多研究表明, 碳链越长, 亲和性越大。

它的最大反应速度随着碳链延长而增加, 呈线形变化。

糖化酶主要作用于α-1,4糖苷键, 对α-1,6 和β- 1,3 糖苷键也具有活性作用。

管汉成等[5]对黑曲霉变异株T-21葡萄糖淀粉酶的底物特异性进行了研究, 发现糖化酶GAⅠ仅能水解多种淀粉及麦芽低聚糖生成唯一产物β-葡萄糖,不能水解甘露糖、木聚糖、地衣多糖、右旋糖苷及α- ,β- ,γ- 环状糊精,说明GAI对多糖中糖的组成及糖苷键具有较强的专一性。

2糖化酶的分离纯化研究史及工业化生产方法2.1糖化酶分离纯化研究史糖化酶的分离纯化是其进一步应用的基础，随着糖化酶的应用领域不断扩大和细化，开发筛选具有各种特性的糖化酶成为目前酶制剂研究领域的一个重要方向。

糖化酶的分离纯化主要包括细胞破碎、提取、离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离、电泳分离和萃取分离等方法。

X贺迎等人[6]研究了耐热糖化酶的分离纯化，通过细胞破碎、过滤、离心得到粗酶液，再将粗酶液用45 %～80 % 硫酸铵分级沉淀, 以去除部分色素和杂质蛋白。

沉淀先后用水、pH4.6 0.1 mol/L的HAC- NaAC缓冲液透析平衡,上DEAE-Cellulose-52离子交换柱层析。

再经过洗脱,收集对应于各洗脱峰的洗脱液得到了分离纯化后的耐热糖化酶，他们利用DEAE- Cellulose- 52 柱层析和制备电泳纯化得到了3 个耐热糖化酶组分，并测定了3个耐热糖化酶的最适温度和分子量。

李彧娜、石XX等人[7]从Rhizopus microsporus var.chinensis CICIM F0088菌株中分离纯化一种新的具有生淀粉降解能力的糖化酶，在分离纯化过程中，经过硫酸铵沉淀、双水相交换、DEAE-650M 阴离子层析、再经含0.100、200、300 mmol/L NaCl的醋酸–醋酸钠缓冲液（pH 6.0）梯度洗脱后，合并收集的活性组分，透析后冻干浓缩,冻干的酶粉用醋酸–醋酸钠缓冲液（pH 6.0）复溶，在Bio-Rad Model 491 Prep Cell上进一步分离，可收集的到得纯化后的样品。

李彧娜、石XX等人在KW-802.5 Shodex 凝胶过滤柱（300 mm ×8 mm I.D.）上测定表观相对分子质量，其相对分子质量约为52×103。

潘丽军，X志英等人[8]对米根霉葡萄糖淀粉酶进行了分离纯化，经硫酸铵盐析、透析脱盐、Sephadex G-100柱层析等纯化步骤，葡萄糖淀粉酶比活力提高了23倍，，并用SDS-PAGE测得提纯后酶的相对分子量约为75.5kD。

此外，Michele Michelin等人[9]用离子交换层析和sephadx G-100对宛氏拟青霉产生的糖化酶进行了分离纯化,并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定出了其分子量为86.5 kDa。