无菌操作原则2008-6-23 15:4【大中小】【我要纠错】1、环境要清洁，进行无菌操作前半小时，须停止清扫地面等工作。

避免不必要的人群流动，防止尘埃飞扬。

治疗室应每天用紫外线消毒一次。

2、进行无菌操作时，衣帽穿戴要整洁。

帽子要把全部头发遮盖，口罩须遮住口鼻，并修剪指甲、洗手。

3、无菌物品与非无菌物品应分别放置。

无菌物品不可暴露在空气中，必须放于无菌包或无菌容器内，无菌物品一经使用后，必须再经灭菌处理后方可使用。

从无菌容器中取出的无菌物品，虽未使用，也不可放回无菌容器内。

4、无菌包应注明物品的名称、消毒灭菌日期，并按日期先后顺序排放，以便取用，放在固定的地方。

无菌包在未污染的情况下，可保存7-14天，过期应重新灭菌。

5、取无菌物品时，必须用无菌持物钳（镊）。

未经消毒的用物不可触及无菌物或跨越无菌区。

6、进行无菌操作时，如器械、用物疑有污染或已被污染，即不可使用，应更换或重新灭菌。

7、一份无菌物品，只能供一个病员使用，以免发生交叉感染。

无菌操作注意事项：1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 %ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。

每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。

实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。

操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。

2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。

实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。

实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。

3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。

勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。

容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。

4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。

对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。

操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。

5. 定期检测下列项目：5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。

5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。

6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水植物外植体消毒和接种：用于进行组织培养的组织、器官和细胞称为外植体。

在组织培养中，外植体如果是带菌的，在接种前都必须进行表面消毒，这是取得培养成功的最基本的和重要的前提。

常用消毒剂对外植体进行消毒。

从室外取的材料，一般先用自来水冲洗数分钟，对表面不光滑或长有绒毛等结构不容易洗净的材料，自来水冲洗的时间要长，几个小时或过夜，并且用洗衣粉或洗洁精洗涤，必要时用毛刷刷洗。

洗后的材料用滤纸擦干，然后浸泡在消毒溶液中。

接种材料使用消毒剂后，要用无菌水洗涤3～5 遍，最后用无菌纸擦干净。

使用消毒剂的原则是既要达到消毒目的，又不能损伤植物组织和细胞，还要符合就地取材的原则。

对一些容易污染、较难灭菌的外植体进行表面消毒时，用单一消毒剂不能收到好的效果，所以常选用两种消毒剂交替浸泡法。

一般，首先用75％乙醇浸泡外植体数秒钟至30s，然后置于0.1％氯化汞溶液5～10min 或含有2％活性氧的次氯酸钠溶液5～30min，然后用无菌水洗涤。

有时在氯化汞或次氯酸钠灭菌后，用无菌水洗，进一步剥去几层组织或器官如叶片后，再用次氯酸钠灭菌3～5min，无菌水漂洗3 次后，切割、用于接种。

用消毒剂对接种材料进行灭菌处理时，可以在灭菌溶液中加入1～2 滴表面活性剂，如吐温80或吐温20，它们可以湿润外植体整个组织，促进灭菌液充分接触表面组织，达到较好的消毒效果。

有时还可以用磁力搅拌、超声振动等方法使消毒杀菌剂进入外植体。

消毒溶液对外植体消毒是在超净工作台上进行。

完成表面消毒的接种材料要尽快放置于培养基中。

植物外植体消毒和接种(以胡萝卜为例)：1 ．接种前，用75 ％乙醇棉球或用2％苯扎溴铵溶液擦拭超净工作台台面，将培养基及用具放入工作台，开超净工作台紫外灯照射至少20 min，然后开送风开关，之后关闭紫外灯，通风10 min后，再开日光灯进行无菌操作。

2 ．将胡萝卜块根在自来水下冲洗干净，用小刀切去外围组织，切成小块分别放100 mL 烧杯中，用75％乙醇溶液浸泡30s，然后用0.1%氯化汞溶液分别浸泡2 、5 、10 min ，用无菌水洗涤3 次，无菌纸吸干水分。

取出培养皿，剪刀和镊子使用前插入90％乙醇溶液中，使用镊子时在酒精灯火焰上炽烧片刻，冷却后，切取髓部组织0.5cm 。

以上操作都要在试管口靠近火焰旁。

3 ．将培养容器斜面向上，并使它们拉于水平位置，也可将培养容器放在左手中。

将塞盖用右手拧转松动，以便接种时拔出。

用火焰灼烧管口，灼烧时应不断转动试管口（靠手腕的动作，使试管口沾染的少量菌得以烧死）。

将烧过的接种针（环）触动培养基部分，使其冷却，以免烧死被接种的外植体，然后轻轻接触外植体，慢慢将接种针（环）抽出试管，打开培养容器盖，将外植体放在培养基上，每瓶放3 块。

封口，贴标签，注明姓名，标明时间和材料名称。

整理好接种室（箱）的台面，搞好清洁卫生。

4 ．用水洗干净非洲澎蜞菊叶片，用滤纸擦干后置于100 mL 烧杯中，在超净工作台上加入75％乙醇溶液浸泡30s，然后用0.1％氯化汞溶液浸泡3 、5 、7 min，用无菌水洗涤3 次，将叶片切成长1cm ,按照上述同样的步骤接种于培养基上。

5 ．绿豆种子用75％乙醇溶液浸泡30 s，然后用0.1％氯化汞溶液（加入吐温2 滴）浸泡3 、5 、10 min ，期间不断搅拌溶液，用无菌水洗涤5～6 遍，洗干种子外围水分，按照上述同样的步骤接种于培养基上。

无菌操作原则：一、在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌区。

二、执行无菌操作前，先戴帽子、口罩、洗手，并将手擦干，注意空气和环境清洁。

三、夹取无菌物品，必须使用无菌持物钳。

[无菌操作间]无菌操作间四、进行无菌操作时，凡未经消毒的手、臂、均不可直接接触无菌物品或超过无菌区取物。

五、无菌物品必须保存在无菌包或灭菌容器内，不可暴露在空气中过久。

无菌物与非无菌物应分别放置。

无菌包一经打开即不能视为绝对无菌，应尽早使用。

凡已取出的无菌物品虽未使用也不可再放回无菌容器内。

六、无菌包应按消毒日期顺序放置在固定的柜橱内，并保持清洁干燥，与非灭菌包分开放置，并经常检查无菌包或容器是否过期，其中用物是否适量。

七、无菌盐水及酒精、新洁尔灭棉球罐每周消毒一次，容器内敷料如干棉球、纱布块等，不可装得过满，以免取用时碰在容器外面被污染。

原则及注意事项无菌操作原则：一、在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌区。

二、执行无菌操作前，先戴帽子、口罩、洗手，并将手擦干，注意空气和环境清洁。

三、夹取无菌物品，必须使用无菌持物钳。

无菌操作间四、进行无菌操作时，凡未经消毒的手、臂、均不可直接接触无菌物品或超过无菌区取物。

五、无菌物品必须保存在无菌包或灭菌容器内，不可暴露在空气中过久。

无菌物与非无菌物应分别放置。

无菌包一经打开即不能视为绝对无菌，应尽早使用。

凡已取出的无菌物品虽未使用也不可再放回无菌容器内。

六、无菌包应按消毒日期顺序放置在固定的柜橱内，并保持清洁干燥，与非灭菌包分开放置，并经常检查无菌包或容器是否过期，其中用物是否适量。

七、无菌盐水及酒精、新洁尔灭棉球罐每周消毒一次，容器内敷料如干棉球、纱布块等，不可装得过满，以免取用时碰在容器外面被污染。

无菌操作技术及注意事项1、玻璃器皿的消毒和清洁⑴新购玻璃器皿的处理新购玻璃器皿应用热肥皂水洗刷，流水冲洗，再用1%～2%盐酸溶液浸泡，以除去游离碱，再用水冲洗。

对容量较大的器皿如试剂瓶、烧瓶或量具等，经清水洗净后应注入浓盐酸少许，慢慢转动，使盐酸布满容器内壁数分钟后倾出盐酸，再用水冲洗。

⑵污染玻璃器皿的处理①一般试管或容器可用3%煤酚皂溶液或5%石炭酸浸泡，再煮沸30分钟，或在3%～5%漂白粉澄清液内4小时，有的亦可用肥皂或合成洗涤剂洗刷使尽量产生泡沫，然后用清水冲洗至无肥皂为止。

最后用少量蒸馏水冲洗。

②细菌培养用的试管和培养皿可先行集中，用1kg/cm2高压灭菌15～30分钟，再用热水洗涤后，用肥皂洗刷，流水冲洗。

③吸管使用后应集中于3%煤酚皂溶液中浸泡24小时，逐支用流水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗。

④油蜡沾污的器皿，应单独灭菌洗涤，先将沾有油污的物质弃去，倒置于吸水纸上，100℃烘干半小时，再用碱水煮沸，肥皂洗涤，流水冲洗。

必要时可用二甲苯或汽油去油污。

⑤染料沾污的器皿，可先用水冲洗，后用清洁或稀盐酸洗脱染料，再用清水冲洗。

一般染色剂呈碱性，所以不宜用肥皂的碱水洗涤。

⑥玻片可置于3%煤酚皂溶液中浸泡，取出后流水冲洗，再用肥皂或弱碱性煮沸，自然冷却后，流水冲洗。

被结核杆菌污染或不易洗净的玻片，可置于清洁液内浸泡后再冲洗。

2、无菌器材和液体的准备将玻璃器具中的培养皿、培养瓶、试管、吸管等按上述方法洗净烘干后，用一洁净纸包好瓶口并把吸管尾端塞上棉花，装入干净的铝盒或铁盒中，于120℃的干燥箱中干燥灭菌2小时，取出备用。

对于手术器械、瓶塞、工作服以及新配制的PBS洗液，则采用高压蒸气灭菌法，即在15磅的条件下，加热20分钟。

而对于MEM培养液、小牛血清和消化液等需用G5或G6滤器负压抽滤后使用。

3、无菌操作过程在无菌操作过程中，最重要的是要保持工作区的无菌、清洁。

因此，在操作前20～30分钟要先启动超净台和紫外灯，并认真洗手和消毒。

在操作时，严禁喧哗，严禁用手直接拿无菌物品，如瓶塞等，而必须用消毒的止血钳、镊子等。

培养瓶应在超净台内操作，并且在开启和加盖瓶塞时需反复用酒精灯烧。

对于吸管应先用手拿后1/3处，戴上胶皮乳头，并用酒精灯烧烤之后再吸液体。

4、常用清洁液的配制法⑴重铬酸钾清洁液：可根据不同需要，选用下列的任何一种浓度。

先将重铬酸钾溶于水中，再慢慢加入浓硫酸。

注意，此时可产生高热，应防止容器破裂。

重铬酸钾清洁液除污力强，腐蚀性大，应避免接触皮肤和衣服。

为防止吸收空气的水分而变质，此液应贮存于带盖的容器中。