1.介绍一种新的DNA序列改造的分子生物学技术原理。

提示（Cre/crop、Golden gate、Gibson assembly、Omega PCR）
答：Cre/crop:
Golden gate
2.介绍一基因沉默或敲除的分子生物学技术原理？
提示：iRNA、TALEN、CRISPR-Cas9等
答：RNAI: RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA （double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。

由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，（长度超过三十的dsRNA会引起干扰素毒性）所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。

作用机制:病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。

宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，
其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA （大约21～23 bp），即siRNA。

siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。

RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。

被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。

siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。

RNAi发生于除原核生物以外的所有真核生物细胞内。

需要说明的是，由于dsRNA抑制
基因表达具有潜在高效性，任何导致正常机体dsRNA形成的情况都会引起不需要的相应基因沉寂。

所以正常机体内各种基因有效表达有一套严密防止dsRNA形成的机制。

TALEN:
TALENs充分利用植物病原菌黄单胞菌(Xanthomonas)自然分泌的蛋白---即激活因子样效应物(TAL effectors, TALEs)---的功能：该蛋白能够识别特异性DNA碱基对。

人们可以设计一串合适的TALEs来识别和结合到任何特定序列，如果再附加一个在特定位点切断DNA双链的核酸酶，就可以构建出TALEN，利用这种TALEN就可以在细胞基因组中引入新的遗传物质。

相对锌指核酸酶(zinc-finger nuclease, ZFN)而言，TALEN能够靶向更长的基因序列，而且也更容易构建。

但是直到现在，人们一直都没有一种低成本的而且公开能够获得的方法来快速地产生大量的TALENs。

[2]
TALENs(transcription activator-like (TAL) effector nucleases)的中文名为转录激活因子样效应物核酸酶，是基因组编辑核酸酶三大类之一。

TALENs由于具有一些比锌指核酸酶(ZFNs)更优越的特点，现在成为了科研人员用于研究基因功能和潜在基因治疗应用的重要工具。

是目前最有发展前景的基因组修饰技术。

3.介绍一种研究大分子相互作用的分子生物学技术原理？
提示：yeast- one-hybrid、yeast two-hybrid、co-immunoprecipitation、bifc、fret等
答：FRET]即荧光能量共振转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)是较早发展起来的一门技术，而荧光能量共振转移现象是20世纪初发现的，随着绿色荧光蛋白应用技术的发展，FRET已经成为检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，在生物大分子相互作用分析、细胞生理研究、免疫分析等方面有着广泛的应用。

2原理
荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。

当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）。

在生命科学领域，FRET技术是检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，可用于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。

正如前述，当供体发射的荧光与受体发色团分子的吸收光谱重叠，并且两个探针的距离在10nm范围以内时，就会产生FRET现象。

而在生物体内，如果两个蛋白质分子的距离在10nm之内，一般认为这两个蛋白质分子存在直接相互作用。

FRET技术得以在生物体内广泛应用，与绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的应用和改造是密不可分的。

GFP由11个β片层组成桶状构成疏水中心，由α螺旋包含着的发光基团位于其中。

这个发光基团(chromophore)是由3个氨基酸（Ser65、Tyr66、Gly67）经过环化、氧化后形成的咪唑环，在钙离子激发下产生绿色荧光。

野生型GFP吸收紫外光和蓝光，发射绿光。

通过更换GFP生色团氨基酸、插入内含子、改变碱基组成等基因工程操作，实现对GFP的改造，如增强其荧光强度和热稳定性、促进生色团的折叠、改善荧光特性等。

GFP近年来发展出了多种突变体，通过引入各种点突变使发光基团的激发光谱和发射光谱均发生变化而发出不同颜色的荧光，有BFP，YFP，CFP等。

这些突变体使GFP应用于FRET成为可能,为FRET技术用于活体检测蛋白质相互作用提供了良好的支持。

青色荧光蛋白（cyan fluorescent protein, CFP）、黄色荧光蛋白（yellow fluorescent protein,
YFP）为目前蛋白-蛋白相互作用研究中最广泛应用的FRET对。

CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱相重叠。

将供体蛋白CFG和受体蛋白YFG分别与两种目的蛋白融合表达。

当两个融合蛋白之间的距离在5-10nm的范围内，则供体CFP发出的荧光可被YFP吸收，并激发YFP发出黄色荧光，此时通过测量CFP荧光强度的损失量来确定这两个蛋白是否相互作用。

两个蛋白距离越近，CFP所发出的荧光被YFP接收的量就越多，检测器所接收到的荧光就越少。

如Tsien & Miyawaki采用FRET技术检测细胞内Ca2+的浓度变化。

他们将CFP和YFP分别于钙调蛋白和钙调蛋白结合肽融合表达于同一个细胞内。

当细胞内具有高的Ca2+浓度时，钙调蛋白和钙调蛋白结合肽结合，可诱发FRET，使受体蛋白YFP发出黄色荧光，因此细胞呈黄色。

当细胞内Ca2+浓度低时，FRET几乎不发生，因此检测时CFP被激发，发出绿色荧光，细胞呈绿色。