实验28 植物体内可溶性蛋白质含量的测定
植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。

在研究每一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位／mg蛋白）表示酶活力大小及酶制剂纯度。

因此，测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。

常用测定方法有Lowry法和考马斯亮蓝G-250染料结合法。

本实验将分别介绍这两种方法。

一、考马斯亮蓝法
【原理】
考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。

考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。

在一定蛋白质浓度范围内（0～100μg/ml），蛋白质－色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。

故可用于蛋白质的定量测定。

蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。

该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。

【仪器与用具】
分光光度计，10ml量筒1支；研体；10ml容量瓶1支；1ml刻度吸管3支；10ml具塞刻度试管14支。

【试剂】
（1）牛血清白蛋白配成1000μg/ml和100μg/ml；
（2）考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。

此溶液在常温下可放置一个月；
（3）90%乙醇；（4）磷酸（85%，W/V）。

【方法】
1.标准曲线的绘制
（1）0～100μg/ml标准曲线的制作取6支试管，按表28-1数据配制0～100μg/ml 血清白蛋白液各1ml。

准确吸取所配各管溶液0.1ml，分别放入10ml具塞试管中，加入5ml 考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，反转混合数次，放置2min后，在595nm下比色，绘制标准曲线。

表28-1 配制0～100μg/ml血清白蛋白液
管号 1 2 3 4 5 6
100μg/ml牛血清蛋白量(ml)
蒸馏水量(ml)
蛋白质含量(mg)
1.0
0.2
0.8
0.02
0.4
0.6
0.04
0.6
0.4
0.06
0.8
0.2
0.08
1.0
0.10
（2）0～1000μg/ml标准曲线的制作另取6支试管，按表28-2数据配制0～1000μg/ml牛血清白蛋白溶液各1ml。

与步骤（1）操作相同，绘出0～1000μg/ml的标准曲线。

表28-2 配制0～1000μg/ml血清蛋白血液
管号7 8 9 10 11 12
1000μg/ml牛血清白蛋白（ml）
蒸馏水量(ml)
蛋白质含量(mg)
1.0
0.2
0.8
0.2
0.4
0.6
0.4
0.6
0.4
0.6
0.8
0.2
0.8
1.0
1.0
2.样品提取液中蛋白质浓度的测定吸取样品提取液0.1ml（样品提取见各酶活测定），放入具塞刻度试管中（设两个重复管），加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min后在595nm下比色，记录吸光度值，通过标准曲线查得蛋白质含量。

3.结果计算
样品蛋白质含量（mg/g鲜重）=W a V
C
式中C－查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg）；
V－提取液总体积（ml）；
a－测定所取提取液体积（ml）；
W－取样量（g）。

二、LOWRY法
【原理】
Lowry法是双缩脲法和福林酚法的结合与发展，其原理是：蛋白质溶液用碱性铜溶液处理，形成铜-蛋白质的络合盐，再加入酚试剂后，除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键、碱性铜的显色效果更强烈。

因此，Lowry法的显色效果比单独使用酚试剂强烈3～15倍，为双缩脲法100倍。

由于肽键显色效果增强，从而减小了因蛋白质种类引起的偏差。

Lowry法的试剂由两部分组成，试剂甲相当于双缩脲试剂（碱性铜溶液），可与蛋白质中的肽键起显色反应；试剂乙为磷钨酸和磷钼酸混合液，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原生成钼蓝和钨蓝混合物而呈蓝色反应，因此蛋白质的酪氨酸和胱氨酸等可显色，颜色深浅与蛋白质含量成正比。