分析化学
结课作业
常见蛋白质测定方法的总结与比较
材料科学与技术学院
林化13-1班
刘旺衢
130534106
常见蛋白质测定方法的总结与比较
刘旺衢
（北京林业大学材料科学与技术学院林化13-1班 130534106，10083）
蛋白质是构成生物体细胞组织的重要成分。

食物中的蛋白质是人体中氮的唯一来源。

具有糖类和脂肪不可替代的作用。

蛋白质与营养代谢、细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、物质运转、遗传等密切相关,是对人类最重要的物质之一。

准确精密的测定蛋白质，关乎人类的生产、生活、生存。

目前测定蛋白质含量的方法有多种,如凯氏定氮法、紫外吸收法、双缩脲法、考马斯亮蓝染色法、酚试剂法等几种方法,下面本文将总结比较这五种蛋白质的测定方法。

一、凯氏定氮法
凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。

即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准酸滴定，就可计算出样品中的氮量。

由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。

蛋白质是含氮的有机化合物。

蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。

然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数计算蛋白质含量，即含氮量*6.25=蛋白含量。

凯氏定氮法具有灵敏度高, 样品用量少，最低可检出0.05mg氮；精密度、准确度高,平行误差一般小于0.5%；应用范围广,适用于一切形态的食品与生物样品；仪器装置简单,试剂廉价的优点。

但也存在操作比较繁琐费时,特别是蒸馏定氮过程的效率低,不利于大批样品的测定；定氮的结果既包括有机氮,也包括无机氮,有机氮中除蛋白氮外,还包括非蛋白氮,测定的结果只能是粗蛋白质的含量；在蛋白质氨基酸构成有差异的
情况下,特别是大量含碱性氨基酸、氨基酸酞氨和小分子量氨基酸的蛋白质,其含氮量就高,必须要根据不同的样品选择对应的换算系数。

但处理未知样品时,其误差就有变大的危险,一般可产生几个百分数的误差等缺点。

总结：凯氏定氮法是标准的测蛋白质的含量的方法，有着较高的准确度和精密度，其对实验试剂、器材要求叫低，是一种适合广泛使用的蛋白质含量粗测方法。

但由于将测蛋白质的含量转化为测氮的含量，这一替代的过程，使得可以通过添加三聚氰胺之类物质虚增蛋白质，危害食品安全和人民健康。

总的来说，凯氏定氮法有优点也有缺陷，实际运用中可结合其他方法尽量减少缺陷。

二、双缩脲法
双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物，在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色络合物，此反应即为双缩脲反应。

含有两个或两个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应。

蛋白质含有多个肽键，在碱性溶液中能与Cu2+络合成紫红色化合物。

其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，可以用比色法进行测定。

由于双缩脲法是通过测蛋白质中的肽键的含量来测定蛋白质的含量，所以此方法的准确性比凯氏定氮法高。

其次，它用来吸光光度法来测定含量，精确度高。

但用双缩脲法测的灵敏度低，测定范围窄，样品需要量大。

只能用于测定还有两个或两个以上肽键的蛋白质，有一定局限性。

总结：双缩脲法的优点在于它用双缩脲试剂作为显色剂，用吸光光度法来测量蛋白质中肽键的含量，与凯氏定氮法相比已经有了改进，更精准的测定了蛋白质的含量。

但它只能用于测定还有两个或两个以上肽键的蛋白质，且分析实验仪器较为复杂，不利于推广，仅使用于定性检测，不适用于定量检测。

三、紫外吸收法
蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280 nm 处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。

此外,蛋白质溶液在 238 nm 的光吸收值与肽键含量成正比。

利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。

紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定。

特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，利用280nm进行紫外检测，来判断蛋白质吸附或洗脱情况是最常用的方法。

紫外吸光法特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。

故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。

若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。

核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。

但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。

总结:紫外吸收法有很多优点，它简便、灵敏、快速，不消耗样品，而且测定后仍能回收使用。

其通过蛋白质中特定的键对光的吸收性质来测量，可以避免加含氮物质虚增蛋白质的发生。

但是实验测定时干扰较多，往往不能精确测定。

四、酚试剂法
此法的显色原理与双缩脲法是相同，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。

这两种显色反应产生深蓝色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。

Folin—
酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物）。

在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的含量成正比。

酚试剂法由于添加了Folin—酚试剂，以增加显色量，比双缩脲法灵敏的多。

但是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。

对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰反应。

总结：酚试剂法是对双缩脲法的一种改进，它的灵敏度很高，但是时间长，显色剂不易制取，操作精度难度要求较大，且同样容易受干扰。

五、考马斯亮蓝法
考马斯亮蓝法是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。

考马斯亮蓝是一种有机染料，在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色，其最大吸收波长从 465 nm 变为 595 nm, 蛋白质在 1-1 000 μg 范围内, 蛋白质－色素结合物在 595 nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比,故可用于蛋白质的定量测定。

考马斯亮蓝与蛋白质结合反应十分迅速而稳定,2 min 左右即达到平衡,其结合物室温下 1 h内保持稳定，且在 5-20 min 之间,颜色的稳定性最好。

该法方法简便,易于操作,所用试剂较少,显色剂易于配制。

干扰物质少,如糖、缓冲液、还原剂和络合剂等均不影响显色。

用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用γ球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。

标准曲线也有轻微的非线性,因而不能用Beer 定律进行计算,而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。

总结：考马斯亮蓝法也是吸光光度法来测量蛋白质含量的方法。

它的灵敏度与其他测蛋白质的方法相比是最高的，用时很短且结合稳定。

但是由于试剂及仪器还是相对复杂，在生产生活中的应用可能受限。

总的来说，五种蛋白质含量的测定方法各有有缺，有的简单易行，有的精确，有的廉价。

在实际运用中，如果需要准确的定性定量检测蛋白质，确保安全，不妨可以多种方法一起使用，相互比较避免诸如凯氏定氮法不能区分含氮物质还是蛋白质，几种吸光光度的分析方法容易被干扰等劣势，从而准确精密的测出蛋白质的含量。