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Internal structures of cell can be seen with light microscope
一、光学显微镜技术 二、电了显微镜技术 三、扫描隧道显微镜(STM)
一、光学显微镜技术
Stained with hematoxylin and eosin
Extracellular matrix stained blue
2、荧光显微镜技术Fluorescence Microscopy
在紫外光显微镜基础上发展而来，利用样品自发荧 光和诱发荧光，可以对某些生物大分子进行定性和 定 位研究。不仅可以观察固定切片标本，还可以在活体 染色后对活细胞进行研究。
微分干涉显微镜
（differential-interference microscope）
1、普通复式光学显微镜技术
普通光学显微镜（最大分辨率为0.2µm）， 主要由三部分组成：
①光学放大系统，即目镜和物镜； ②照明系统； ③机械和支架系统。
显微镜的性能优劣决定于它的分辨率。分辨率 是指显微镜区分开相近两点的能力。
1. 超薄切片
通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环 氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的 方式推进样品切片，切片厚度 20~50nm ，切片采用重金属盐染色， 以增大反差
超薄切片技术
切片流程图
超薄切片机
Electron micrograph of a cell in a root tip
Transmission electron micrograph of a liver cell in cross section
还有哪些显色方法？
三、特异蛋白质抗原的定位与定性
免疫荧光和免疫电镜是最常用的细 胞内蛋白质定位技术。
1、免疫荧光技术
免疫荧光技术就是将免疫学方法与 荧光标记技术相结合研究特异蛋白质 抗原在细胞内分布的方法。
2、免疫电镜技术
免疫电镜技术使特异蛋白的定位与超微结 构结合起来，使抗原定位更准确。如蛋白 分泌的研究胞内酶的研究；一些结构蛋白 的研究。 免疫电镜技术可分为免疫铁蛋白技术，免 疫酶标技术，免疫胶体金技术。
细胞提取物，细胞核提取物
原代培养的绍鸭成纤维细胞，相差显微镜照片
传代培养的绍鸭成纤维细胞形态（DAPI染色）
正常细胞
凋亡细胞
分裂中期细胞
植物组织培养
二、细胞工程
1，细胞融合与杂交 植物细胞先去壁； 融合方式：仙台病毒或聚乙二醇介导，电融合等 同核融合细胞，异核融合细胞，染色体丢失 2，单克隆抗体技术 1975年英国科学家Milstein and Kohler, 1984年获诺 贝尔奖 B淋巴细胞 + 小鼠骨髓瘤
六、定量细胞化学技术
显微分光光度术 （紫外显微分光光度、可见光显微分光光度染色） 流式细胞仪
流式细胞术
第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术
一、细胞培养
1，动物细胞 （原代细胞培养，传代细胞，细胞株，细胞系） 2，植物细胞 （单倍体细胞培养，原生质体培养，组织培养） 3，非细胞体系 （DNA复制，RNA转录，蛋白质合成，高尔基体 的膜泡 运输，细胞核装配等）
胶体金
是由氯金酸在还原剂作用下，聚合成特定 大小的金颗粒， 微小金颗粒稳定地、均匀 地、呈单一分散状态悬浮在液体中，成为 胶体金溶液。
胶体金在弱碱环境种带负电荷，可与蛋 白质的正电荷结合，不影响蛋白质的性质。
四、细胞内特异核酸的定位与定性
1、原位杂交技术
用标记的核酸探针通过分子杂交确定特殊核苷酸序 列在染色体上或细胞中的位置的方法。
电镜的基本构造包括：
①电子束照明系统 ； ②电磁透镜成像系统； ③真空系统； ④记录系统； ⑤电源系统。
光镜显微镜与电子显微镜的比较
发光源 光源 透镜 真空系统 成象色彩 标本制作
光学显微镜 灯泡 可见光、紫外光 玻璃透镜 空气 彩色 石蜡、冰冻切片
电子显微镜 电子枪 电子束 电磁透镜 真空 单色 超薄切片
细 胞 生 物 学
Cell Biology
课程内容
第一章
绪论
第二章
细胞基本知识概要
第三章 细胞生物学研究方法
第四章
细胞质膜与细胞表面
第五章 细胞质基质与内膜系统
第六章
细胞的能量转换
第七章
细胞核与染色体
第八章 细胞增殖及其调控
第九章
核糖体
第十章
细胞骨架
第十一章 细胞分化与基因表达调控
第十二章 细胞衰老与凋亡
差速离心与密度梯度离心相结合可以达到精 确的分离。
差速离心
各种生物大分子蔗糖中的密度
名称
密度 g/cm3
质膜
1.06-1.10
光滑的内质膜网
1.06
高尔基器、高尔基体
1.16
完整致癌病毒
1.16-1.18
线粒体
1.19
溶酶体
1.21
过氧化物的酶体
1.23
植物病毒
1.30-1.45
可溶性蛋白
1.30
0·61λ D=
N · sinɑ/2
λ: 光源波长; α: 物镜镜口角; N: 介质折射率
Duct composed of closely packed cells
Nuclei stained red
Stained tissue section showing urinecollecting Ducts in the kidney
蚀刻后，向断面以45度角喷涂一层蒸汽 铂，再以90度角喷涂一层碳，加强反差 和强度。然后用次氯酸钠溶液消化样品， 把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜。 复膜显示出了标本蚀刻面的形态，在电 镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂 面处的结构
4. 扫描电子显微镜
（scanning electron microscope，SEM） 扫描电子显微镜于20 世纪60 年代问世，用 来观察标本的表面结构。
4、相差显微镜技术
Phase-contrast microscopy
相差显微镜由P．Zernike 于1932年发明，并因 此获1953 年诺贝尔物理奖。
特点：样品不需染色，适合观察活细胞。甚至研 究细胞核、线粒体等细胞器的动态。
Bright field and phase contrast
5 微分干涉显微镜技术
普通复式光学显微镜
（light microscope）
荧光显微镜
（fluorescence microscope）
激光共聚焦显微镜
（laser scanning confocal microscope）
相差显微镜
（phase-contrast microscope） （光程差或相位差转变为振幅差，相差板）
荧光显微镜及其照片
微管呈绿色、微丝红色、核蓝色
Fluorescent Image of a Cell in Mitosis
Spindle microtubules
revealed with a green fluorescent
antibody
Centromeres – red fluorescent
2. 负染技术
负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展 在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品 凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉 积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm 左右。
3. 冰冻蚀刻（freeze-etching）
冰冻蚀刻亦称冰冻断裂（freezefracture）。标本置于-100°C的干冰或196°C 的液氮中，进行冰冻。然后用 冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真 空条件下迅即升华，暴露出断面结构， 称为蚀刻（etching）。
原理： 次级电子 光信号 电信号 显示出与电子束同步的扫描图像。
作用：主要用于观察样品表面的形貌特征。
三、扫描隧道显微镜(STM)
是一种探测微观世界物质表面形貌的仪器，在 纳米生物学的研究领域具有独特的优越性。 STM的特点：
①具有原子尺度的高分辨本领； ②可在真空、大气、液体等条件下工作； ③非破坏性测量。
（二）主要电镜制样技术介绍
主要的用于观察生物样品的电镜技术有： ①超薄切片技术；是观察细胞超微结构的基础。 ②负染色技术； ③冷冻断裂和冷冻蚀刻电镜技术技术； ④ 电镜三维重构技术； ⑤扫描电镜技术（SEM）；是观察细胞表面形貌 的有力工具。
样品制备技术的特殊要求： ①样品要薄； ②更好地保持样品的精细结构； ③样品具有一定的反差。
激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态 以及亚细胞形态和组分。
激光共聚焦原理
激光共聚焦扫描显微镜
LCSM Image of a Xenopus Melanophore microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue)
A mitotic fertilized egg from sea urchin
Differential interference microscopy (DIC) 微分干涉显微镜用的是偏振光，增加了样品 反差，并具有立体感，可作于研究活体细胞 中较大的细胞器。
二、电了显微镜技术
（一）电了显微镜基本知识
分辨率最终决定于光的波长，由于使用电子 薄切片厚度的1/10，它的 分辨率可达0.2nm，其放大倍数为106倍。
透射电子显微镜
JEM-1011 透射电子显微镜
透射电镜
第二节 细胞组分的分析方法
一、高速、超速和梯度密度离心分离各种细胞 器、生物大分子及其复合物
利用多种方法使细胞崩解，形成细胞器和细 胞组分的混合匀浆，再通过差速离心，即利用 不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种 亚细胞组分和各种颗粒分开。