8、二硫键剪切后形成新氨基酸（赖氨丙氨 酸、） 9、天冬酰胺脱氨
辅酶分子从活性部位上解离
寡聚蛋白解离成亚基
吸附到容器表面
“不可逆”构象改变 流体中的剪切失活
变性条件
加热，变性剂脲，盐酸胍, SDS, 振动
极端pH值，加热，蛋白水解酶 氧气（特别在加热时）氧气代谢产物，辐射 加热，高pH，巯基化合物,二硫化物 金属离子，二硫化物 蛋白激酶 底物
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Hale Waihona Puke 四、氧化作用各种氧化剂能氧化带芳香族侧链的氨基酸以及蛋氨酸、 半胱氨酸和胱氨酸残基。分子氧，H2O2和氧自由基是常 见的蛋白质氧化剂。在过渡金属离子（如Cu2+存在下） ，于碱性pH，半胱氨酸可氧化成胱氨酸。氧化剂强度不 同，半胱氨酸也可转变成次磺、亚磺或磺（半胱氨）酸 。
H2O2是非专一性氧化剂。在酸性条件下，它主要把蛋 氨酸氧化成它的亚砜。
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五、表面活性剂和去污剂
表面活性剂是由疏水基团和亲水基团组成的化合物。 去污剂有离子性和非离子性两大类，都含有长链疏水尾巴 但“头”部基团不同，有带电的，有不带电的
去污剂在很低浓度下能使蛋白质发生强烈的相互作用，导 致蛋白质不可逆变性。
去污剂的关键物理性质是其溶解度。如图4-7所示，当去 污剂单体加入水溶液时，一部分溶解，一部分在气-水界 面形成单层。
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7、疏水相互作用
带有非极性侧链的氨基酸大约占蛋白质分子总体积 的一半。它们与水的接触从热力学上来说是不利的 ，因为非极性部分加入水中，会使水的结构更有序 地排列。 水分子的这种结构重排，显然能引起系统的熵降低 和蛋白质折叠状态的改变：蛋白质的非极性部分总 是倾向于使其不与水接触，并尽可能地隐藏在蛋白 球体内部。从而蛋白质稳定性增加。
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4． 二硫键
大分子的分子内交联可增强其坚实性，并提高 其在溶液中的稳定性。
稳定化指的是熵性质：由于交联即蛋白质中形 成二硫键，伸展蛋白质的熵急剧降低
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物质的熵是它所处状态的分子混乱度 (也称无序度)的度量。熵值小的状态对 应比较有序的状态,熵值大的状态对应比 较无序的状态。 一种物质从固态到液态到气态,分子热运 动的混乱程度依次增强,而熵值也依次增 大。
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1、必须发生单分子构象变化，导致蛋白质可逆变性。这 个过程使包埋的疏水性氨基酸残基暴露于水溶剂。 2、这种三级结构改变了的蛋白质分子彼此缔合，以最大 限度地减少疏水氨基酸残基的不利的裸露。 3、如果蛋白质分子含有半胱氨酸和胱氨酸残基，则会发 生分子间二硫交换反应。 与许多其它蛋白质失活原因不同，聚合并不一定是不可 逆的。使用变性剂破坏分子间的非共价力（氢键或疏水 相互作用）并且在无变性剂时，通过还原和再氧化再生 天然二硫键，则有可能使蛋白质再活化。
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5、对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低 结构上重要的氨基酸残基（如活性部位氨基酸） 的氧化作用是蛋白质失活的最常见的机理之一。 半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚环，对氧化特别 敏感，因此，这些不稳定氨基酸的数目，在高度 稳定的嗜热蛋白质中比在相应的嗜温蛋白质中显 著偏低。
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6、氨基酸残基的坚实装配
蛋白质结构中存在有空隙。按照Chothia说法，蛋白球 体积的大约25%仍未充满，即不是被氨基酸占据。但溶质 分子可以包埋在这些孔隙中。这些孔隙通常为水分子所充 满。分子量为2―3万的蛋白质中约有个5―15水分子 。由 布朗运动调节的极性水分子与球体疏水核的接触会导致蛋 白质不稳定。随着水分子从孔隙中除去，蛋白质结构变得 更坚实，蛋白质的稳定性也增加。因此，蛋白质的坚实化 可作为一种人为稳定蛋白质的方法。
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2、蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用
在体内，蛋白质常与脂类或多糖相互作用，形成复合物， 从而显著增加蛋白质稳定性。
当蛋白质形成复合物时，脂分子或蛋白质分子稳 定到疏水簇上，因而防止疏水簇与溶剂的接触， 屏蔽了蛋白质表面的疏水区域，从而显著增加蛋 白质稳定性
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3、盐桥和氢键 蛋白质中盐桥的数目较少，但对蛋白质稳定性贡 献很显著。嗜热脱氢酶亚基间区域有盐桥协作系 统，这是嗜温脱氢酶没有的。因此嗜热酶的催化 活力的变性温度和最适温度都比嗜温酶高出约 20℃。 用定点突变法定性定量地测定了引入的氢键对蛋 白质的稳定性的贡献，发现加入的氢键与蛋白质 稳定性无关。
第四章 蛋白质的稳定性和稳定化
第一节 蛋白质的稳定性
一、蛋白质的稳定性指的是蛋白质抵抗各种因素的影 响，保持其生物活力的能力。
二、蛋白质稳定性的分子原因
1、金属离子、底物、辅因子和其它低分子量配体的结 合作用。
金属离子由于结合到多肽链的不稳定部分（特别是弯曲处）， 因而可以显著增加蛋白质的稳定性。当酶与底物、辅因子和其 它低分子量配体相互作用时，也会看到蛋白质稳定性的增加。
加热，极端pH 加热，高pH
加热，高PH
螯合剂、透析、加热，金属离子
化学修饰，极端pH, 脲，表面活性剂，高温或低
温 蛋白质浓度低, 加热
加热，极端pH, 有机溶剂,盐酸胍
流体形变
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一、 蛋白水解酶和自溶作用 蛋白水解酶可催化肽键水解。当蛋白质底物也是一种蛋 白水解酶时，就会发生自我降解现象，叫作自溶。 二、聚合 聚合分三步进行：N ← U → A → As 其中N U代表可逆伸展，A是聚合的蛋白质，As是发生了二硫 交换反应的蛋白质聚合物。
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第二节 蛋白质不可逆失活的原因和机理
失活机理
聚合（有时伴随形成分子间二硫键）
一级结构改变
1、酸、碱催化的肽键水解，蛋白水解作用和 自溶作用 2、功能基氧化（半胱氨酸巯基和色氨酸吲哚 环） 3、二硫键还原，分子间二硫交换
4、必需巯基的化学修饰
5、蛋白质磷酸化
6、在催化过程中由于反应中间物（主要是自 由基）引起的“自杀”失活 7、氨基酸的外消旋化
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三、极端pH
硫代半胱氨酸残基
图4-6 碱催化的β-消除反应破坏二硫键，产生新的分子内交联键（赖氨丙氨 酸）。
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肽键水解也容易在强酸条件下或中等pH和高温相结合的条 件下发生。 在极端条件下（6 mol/L HCI，24h, 110℃）蛋白质可完全 水解成氨基酸。 在强酸、中性和碱性pH下容易发生天冬酰胺和谷氨酰胺的 脱氨作用，结果在蛋白质的疏水性内部引进入负电荷，导 致酶失活。