29
光谱扫描
3）VBF，万能滤色片功能
30
XYZ
31
三维切割
32
三维重建
洋葱表皮基因表达 光学切片重建
33
花粉管运输
Tublin+Pollen
34
Ca2+火花的检测（X-T）
~ 50 ms
35
钙震荡
36
共聚焦有哪些优势？
挡住大部分非焦平面信息，大大提高Z轴分辨率 水平分辨率也有一定的提高 可做光学切片和Z轴光切 三维重建 PMT信号采集，增益高/响应时间短/测量精度高 更强的激发（也是其缺点） 实时多通道荧光、透射光观测 ZOOM功能最大限度发挥物镜分辨率 可做局部光操作，如光刺激，光漂白等 光谱拆分功能，区分颜色十分接近的染料 XYZTλ等多维观察 ……
漂白
荧光恢复
47
OLYMPUS独家设计——同步双扫描系统SIM
—— 专利产品, 取图的同时可以任何时间、任何位置进行光刺激。 优点: 取图和光刺激同时进行, 保证时间上连续性, 不会丢失任何图象信息 应用: Uncaging、 FRAP、 FLIP、Photoactivation、Photoconversion
分子间作用距离测量（荧光的效率与距离成6次幂关系，可 以灵敏测量1－10nm内的距离变化）
41
能量共振转移（FRET）
方法一：受体漂白法（Acceptor Photobleach）
Donor pre-bleach
Acceptor pre-bleach
Donor post-bleach
Acceptor post-bleach
37
荧光基础 激光扫描共聚焦显微镜基本原理 激光扫描共聚焦显微镜成像特点
» 薄层光学切片 » ZOOM成像 » 多通道/光谱 » 多维度成像
激光扫描共聚焦的应用
38
能量共振转移（FRET）
FRET: Fluorescence Resonance Energy Transfer
定义： 当两个荧光基团满足一定条件时发生的一种非辐射性的、偶极-偶极配 对过程，借此过程，能量从激发态荧光供体以非常接近的波长转移到荧光受体。
Zoom的极限？
22
ZOOM
多通道荧光同步采集
激光
PMT
TRITC
显微镜
FITC DAPI
pinhole
23
PC
24
Rainbow Mouse
25
光谱扫描
旋转光栅
pinhole
光谱
800
700
PMT
600
500 可 移
400 动 狭 缝
26
光谱扫描
1）获取未知染料的光谱曲线
489 ~ 639 nm
52
快速同步漂白及杀死细胞
53
光诱导（Photo-stimulation）：Kaede蛋白
新的从珊瑚虫体内提取的荧光蛋白 特性： UV光激发Kaede后，蛋白发生光转换： 绿 － 红 基因表达、胞间/内通讯、粒子流动等
KAEDE
KAEDE
LD405（405nm）
KAEDE
光变色
54
Kaede 蛋白
43
荧光漂白后恢复（FRAP）
FRAP（Fluorescence recovery after photobleaching）是用来 测定活细胞的动力学参数,利用荧光标记预先观察蛋白分子和脂膜,借 助于高强度激光来照射细胞某一区域,造成该区域荧光分子的光漂白, 非漂白区域的荧光分子会以一定的速率向受漂白区域扩散,该扩散过 程可通过低强度激光扫描进行探测,因而可得到活细胞的动力学参数。
Acceptor (Ex.) YFP (514nm) TRITC (550nm) Cy5 (649nm) YFP (514nm) Cy3 (554nm)
40
FRET应用
分子内结构变化（蛋白质、DNA构象等）
分子间相互作用（酶活力、离子通道结构变化等）
离子浓度测量（通过构建FRET蛋白测量Ca2+, PH, cAMP等）
55
光诱导（Photo-stimulation）：Dronpa蛋白
Dronpa特点：488激发淬灭<<==>> UV激发活化 观察蛋白动态变化/运输过程、细胞动态、细胞活力
dronpa
488nm
dronpa
强488nm
dronpa
LD405 (405nm)
56
Dronpa蛋白
57
解笼锁
58
/ /
… 用特定波长激发诱导
改变荧光染料颜色…
– 光转化（Photoconversion）
改变荧光染料灰度…
– 光漂白（Photobleaching） – 光活化（Photoactivation） – 光变色（Photochromism）
51
光聚合、融解、杀伤 Kaede
FLIP, 快速FRAP PA-GFP Dronpa
Galactosyltransferase-GFP 核膜
GFP ERCC1/XPF 质膜
E-cadherin-GFP
D (um2s-1)
87 25 5-10 20-30
0.49 0.45 0.26
0.54
15
0.03-0.04
×
√ √
×
√
D > 10 um2s-1 时不适合传统共聚焦操作
46
荧光漂白后恢复(FRAP)
激光扫描共聚焦显微镜 基本原理及应用
奥林巴斯（中国）有限公司 袁振环 2012.5.8
2
荧光基础 激光扫描共聚焦显微镜基本原理 激光扫描共聚焦显微镜成像特点
» 薄层光学切片 » ZOOM成像 » 多通道/光谱 » 多维度成像
激光扫描共聚焦的应用
3
什么是荧光？
DAPI
FITC
MitoTracker
上图为细胞漂白和恢复过程的显示
44
荧光漂白后恢复（FRAP）
应用：
生物膜中脂质分子的侧向扩散，例如膜蛋白或膜脂流动性 （蛋白质在水溶液中的扩散速度大于膜蛋白的扩散速度）；
间接连接及胞间通讯的研究（无机盐，离子，糖，氨基酸， 核苷酸和微生物等）；
胞浆及细胞器内小分子物质转移性的观测等；
细胞骨架构成、核膜结构及大分子组装等。
UV
Violet
<400nm 400nm
Blue 460nm
Cyan 480nm
Green 530nm
Yellow Orange 560nm 580nm
Red 630nm
Near IR >700nm
350nm 400nm
500nm
600nm
700nm
什么是荧光？
高能级、不稳态
能级
低能级、稳态
照明光 (激发光)
无FRET
有FRET
39
能量共振转移（FRET）
FRET产生条件：
1）供体发射谱与受体激发谱重叠； 2）供体受体距离1~10nm； 3）合适的偶极方向； 4）足够的荧光寿命。
常用的FRET组合：
Donor (Em.) CFP (477nm) FITC (520nm) Cy3 (566nm) EGFP (508nm) EGFP (508nm)
45
GFP类荧光在FRAP研究中的扩散速率（D）
分子 水中GFP 细胞质内GFP 内质网内腔内GFP 线粒体内GFP ER 膜 VSVG tsO45-GFP (in ER+BFA32 ℃) VSVG tsO45-GFP (in ER40 ℃) Signal recognition particle β-subunit -GFP 高尔基器膜
650 ~ 703 nm
27
光谱扫描
2）实现光谱拆分，减少荧光串色
Hela细胞：核CFP/
525nm
545nm
565nm
CFP/GFP 光谱拆分前
CFP/GFP光谱拆分后
细胞膜FITC/细胞质GFP Before After
28
光谱曲线图
Unmixing
42
能量共振转移（FRET）
方法一：受体漂白法（Acceptor Photobleach）
Donor pre-bleach
Donor post-bleach
Donor post-bleach – Donor pre-bleach
Efficiency =
Donorpost-bleach – Donorpre-bleach Donorpost-bleach
10 X线上的荧光强度变化
多条线构成2维图像
11
激光扫描共聚焦显微镜 FV1000
扫描单元
显微镜
激光器
电脑/工作站
12
13
荧光基础 激光扫描共聚焦显微镜基本原理 激光扫描共聚焦显微镜成像特点
» 薄层光学切片 » ZOOM成像 » 多通道/光谱 » 多维度成像
激光扫描共聚焦的应用
高分辨率光学切片
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细胞质内多点FRAP
用于研究物质流动，细胞骨架组 成，核膜结构，大分子组装等
北京中医医院
Relative Intensity Relative Intensity
荧光漂白中损失（FLIP）
FRAP
FLIP
Time
FRAP
49
FLIP
Time
50
荧光漂白中损失（FLIP）
中科院植物所
光诱导成像
荧光物质，探针、 染料、蛋白...
4
Stokes频移
荧光 (发射光)
5
荧光显微镜
落射式
6