保健食品为100倍
中药为50倍
17
18
观察指标
一般观察 血液学指标 血液学指标 血液生化学指标
系统尸解和病理组织学检查 可逆性观察 指标观察时间 其他 特异性指标
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（1）一般观察 进食量，体重，外观体征和行为活 动，粪便性状等 重点观察有中毒反应的动物 尸检死亡或濒死动物 计算食物利用率，各组动物实际染毒 剂量
实验动物或人连续较长期接触外源化学物所 产生的中毒效应
5
慢性毒性（chronic toxicity)
24个月或更 长，或终生
实验动物长期染毒外源化学物所产生的毒性 效应
新药临床前毒性评价
取决于拟用药的期限，一般为临床用药的 2‾3倍
6
重复染毒、亚慢性和慢性毒性作用目的
1 观察长期接触受试物的毒性效应谱、毒作用 特点和靶器官；了解其毒性机制 2 观察长期接触受试物毒性作用的可逆性 3 研究重复接触受试物毒性作用的剂量-反应 （效应）关系，确定NOAEL和LOAEL，为制定 人类接触安全限量提供参考值 4 确定不同动物对受试物的毒效应差异，为研 究结果外推到人提供依据 7
9
微生物寄生虫学等级和饲养环境
亚慢性毒性试验应使用清洁级及以上等级动物，饲 养在屏障环境内进行试验 营养合理的饲料，洁净的饮水，清洁无污染的垫料 和笼具 不同项目的试验应分室进行 人工控制昼夜交替 10
染毒方式与染毒期限
一般以经口，经呼吸道和经皮染毒为多 染毒频率为每日一次，连续给予，若试验期超过3 个月，可每周6次 慢性毒性试验的期限取决于试验的具体要求和所 选用的动物物种 工业毒物至少6个月 环境毒物与食品 要求1年或2年 11
（1）小动物常用灌胃法和喂饲法
大鼠、小鼠： 灌胃法 犬：胶囊法或灌胃法 受试物混入饲料，让动物自行食入，其在饲料 中混合均匀，稳定
受试物 90天试验≤ 8 g/100 g 掺入最大量
慢性试验≤ 5 g/100 g
30天试验≤10 g/100 g
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（2）经呼吸道染毒 染毒时间通常为2~6 h/d 在 亚慢性试验 4 h/d 染 毒 间歇性吸入 工业毒物 6~8 h/d 柜 慢性试验 中 连续性吸入 环境接触 22~24 h/d
实验动物给药前禁食处理 大鼠染毒前应隔夜禁食 小鼠可隔夜禁食或禁食4 h以上 禁食期间均正常给予饮水 禁食2 h后提供饲料 受试物及处理 常用水溶液 混悬液 油溶液 染毒最大量 20 ml/kg 染毒方法 经口灌胃染毒 41
剂量选择 试验预试 以10倍剂量初试动物 寻找LD100和LD0 剂量设计 在两者之间设计5~7个剂量组 剂量之间的倍比关系1.6~1.8
观察7~14天
LD50 中毒体征及发生过程、死亡情况和时 间分布、体重和病理形态学变化 42
二 亚慢性毒性作用研究 实验动物 SD大鼠 雌雄各半 染毒途径 经口灌胃/喂饲 6~8 w 80~100 g 每组20只 Beagle犬 每组6只
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剂量选择 高 1/5~1/20LD50 中 1/3~1/10高剂量 低 1/3~1/10中剂量 对照组 每日一次 连续90天
损伤蓄积 (damage accumulation) 出现慢性毒性作用
储存库 /蓄积器官 四氯化碳——肝 铅、汞——骨骼
化学分析、 放射性核素、 生物学方法
4
（二）基本概念
短期重复剂量毒性 28天
实验动物或人连续接触外源化学物14‾30天所 产生的中毒效应 亚慢性毒性（subchronic toxicity) 90天
试验周期在3个月以内的，在最后一 次给药后24小时和恢复期结束时各 进行一次各项指标的全面检测 试验中期检测指标
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（6）特异性指标及其他
特异性指标
能反映毒物对机体毒作用本质的特征性指 标，常与其毒作用机制有关，可作为效应 生物学标志 根据受试物毒性资料，增加一些相关检查项目
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（二）长期毒性试验的注意事项
二 研究方法
（一）试验设计 实验动物的选择 物种和品系
啮齿类：大鼠 非啮齿类：犬 猴 8 Wistar大鼠 SD大鼠 Beagle犬
亚慢性毒性试验
性别、年龄和动物数
一般要求雌雄各半；研究性腺或生殖毒性， 可选用单性别动物 一般为6~8周龄大鼠 大鼠、小鼠每组≥20只；犬、猴每组≥6只 对照组和剂量组动物数应相同，体重（年龄） 一致
短期重复剂量毒性作用 亚慢性毒性作用 慢性毒性作用
试验
2
（一）蓄积作用
化学物质的蓄积作用（accumulation） 外源化学物连续地、反复地进入机体，而且吸 收速度或总量超过代谢转化排出的速度或总量 时，化学物质就有可能在体内逐渐增加并贮留
3
物质蓄积 (material accumulation) 体内测出物质的原形或其代谢物
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一般观察
食物利用率
实验室检测项目 系统尸解和病理组织学检查 可逆性观察 指标观察时间 特异性指标及其他 组织切片 电镜下观察 免疫组化 余1/3动物观察可逆程度和迟缓性毒性
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31
3 相关指标变化
处理组指标变化 病理组织观察
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4 差异大小和性别差异 处理组与对照组之间差异的 大小和类型 雌雄动物对外源化学物的反应类型基本一致
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5 历史性对照的作用 本实验室的历史参考范围
识别异常的阴性对照 更好理解低发生率的发现 判断统计学意义的差异
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为外源化学物管理提供实验室依据
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三 结果评价
与对照相比，观察指标是否有差异 统计学差异 生物学差异
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1. 剂量相关趋势
剂量组和对照组结果之间存在差异 随着受试物剂量水平增加差异增加 —— 效应很可能与受试物有关 没有出现剂量-反应关系 ——初步可以判断与受试物无关
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2 反应重现性 试验结果可重复性
不同时间点 同一物种实验动物在其他独立研究中 另一物种中发生相同的差异
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举例说明如何进行新药临床前的一般毒性 作用研究
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三聚氰胺的一般毒性作用研究
一 急性毒性作用研究
实验动物选择 SD大鼠 180~240 g 昆明小鼠 18~25 g Beagle犬 4~6 kg 健康 刚成年 未曾交配和受孕 实验动物分组 每组 4~6个组 雌雄各半 SD大鼠 10只 昆明小鼠 10只 Beagle犬 6只 40
剂量选择
以相同物种的短期毒性资料为依据
亚慢性试验
急性毒性的阈剂量为最高剂量 LD50的1/5‾1/20剂量
慢性试验 亚慢性试验毒效应的MTD为最高剂量
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剂量设计依据
对于人群主动摄入的食品和药品，可采用 人体可能拟用的最高剂量
大鼠可用人临床拟用剂量的10、30和100倍 非啮齿类可用5、15、50倍 当预期受试物没 化学药品为30倍 有明显毒性时
外源化学物的一般毒性作用
subacute toxicity/repeat dose toxicity subchronic toxicity chronic toxicity 公共卫生与热带医学学院 张文娟 毒理学系 zhangwj11@
第三节
短期、亚慢性和慢性毒性作用
一 概述
研究长期重复接触化学物毒作用的必要性 长期重复接触化学物毒作用分类
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食品安全性毒理学评价试验四个阶段
第一阶段 急性毒性试验（ 经口急性毒性） 第二阶段 遗传毒性试验，传统致畸试验，短期 喟养试验（如受试物需进行第三、四阶段毒性 试验者，可不进行本试验） 第三阶段 亚慢性毒性试验 ─ 90天喟养试验、 繁殖试验、代谢试验 第四阶段 慢性毒性试验（包括致癌试验） 37
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（3）经其他途径染毒 静脉注射 腹腔注射 （4）监测血药浓度 每日染毒时间应保持一致
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剂量选择与分组
一般至少应设3个剂量组 低剂量组 应无中毒反应，相当于NOAEL 中剂量组 约相当于LOAEL 高剂量组 应能引起明显的毒性或少量动物死亡（10%）
组距以3‾10倍为宜，最低不少于2倍
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亚慢性和慢性试验的剂量设计
全面综合分析整个试验期间全部观察和检 验结果 化学物的理化性质、化学结构 应用生物学和医学的基本理论进行科学的 评价
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受试物要求
食品安全性毒理学评价
提供受试物（必要时包括杂质）物理、化学 性质（包括化学结构、纯度、稳定性等） 受试物必须是符合既定生产工艺和配方的 规格化产品，其纯度应与实际应用的相 同，在需要检测高纯度受试物及其可能存 在的杂质的毒性或进行特殊试验时可选用 纯品，或以纯品及杂质分别进行毒性检测
=某个脏器的重量（g)/体重（100 g) 脏器系数
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（4）可逆性观察
最后一次给药后24 h，每组活杀部分动 物，检测各项指标 余下动物停止染毒，继续观察2~4周，重 点观察毒性反应器官，以了解毒性反应的 可逆程度和可能出现的迟缓性毒性
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（5）指标观察时间 每天观察一次 每周记录一次 一般状况和症状 饲料消耗和体重
专业化人才设计项 目实施管理 试验项目管理 保障设施仪器状态良好 专业培训的实验人员
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试验设计合理
足够高的剂量以能观察到受试物的毒性作 用，动物死亡率不能超出10% 阴性结果 严格控制技术规范
可采取多设一个剂量组的方式
成功的试验设计 明确的剂量-反应关系 理想的LOAEL NOAEL
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试验动物环境 标准化 国际化 控制检测条件 检测仪器和辅助条件 短期内准确可靠 长期稳定可比
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（2）实验室检测项目 血液学：RBC HGB WBC PLT
PT PTA Fbg ALP ALB
血液生化学指标：AST L T-CHO 21
（3）系统尸解和病理组织学检查 心 肝 肾 脾 肺 肾上腺 甲状腺 睾丸 卵巢 子宫 脑 前列腺