国家自然科学基金资助项目结题报告资助类别：青年科学基金项目亚类说明：附注说明：项目名称：CPK10基因调控拟南芥响应干旱胁迫的分子机制研究负 责 人：魏凤菊电话：0312-*******电子邮件：weifj98@依托单位：河北农业大学联 系 人：张永升电话：0312-*******资助金额：22（万元）累计拨款：22.0（万元）执行年限：2012.01-2014.122015年01月16日填表日期：国家自然科学基金委员会制（2012年）NS FC-R E PORT -2014412-TROPER-CFSN报告正文一、研究计划要点及执行情况概述。

研究基本按照原计划执行，一些研究内容稍作调整。

（1）检测了CPK10与HSP1蛋白的可能互作方式。

通过酵母双杂交技术得出HSP1可以发生自身互作。

在利用TAP （串联亲和纯化）技术结合质谱技术分析HSP1与CPK10的作用方式过程中，纯化获得的杂蛋白信号较强，试验未能顺利进行下去。

（2）筛选了与CPK10可能互作的其它靶蛋白。

分离保卫细胞并建立酵母cDNA 文库，通过酵母双杂交技术筛选互作蛋白，获得的蛋白经测序分析多为持家基因表达产物，利用构建的保卫细胞酵母文库筛选CPK10互作蛋白的方法暂告一段。

利用串联亲和纯化技术筛选CPK10可能的互作蛋白，再结合质谱分析技术测得蛋白的氨基酸序列，获得多个候选基因。

（3）对靶基因是否参与干旱逆境进行了初步分析。

检测靶基因受干旱诱导后的表达情况，组织及亚细胞表达情况。

（4）初步检测了cpk10突变体材料中靶基因的表达情况，明确的试验结果有待重复。

（5）获得了CPK10与CPK30的双突变体，初步进行了基因功能分析。

二、研究工作主要进展和所取得的成果。

（一）酵母cDNA 文库的构建及筛选将一定数量的拟南芥第3、4轮莲座叶叶片剪下后洗净，放入匀浆机中，加入适量的冷蒸馏水，打磨成碎表皮条，用孔径为75 μm 滤膜过滤，去除含有大量叶肉细胞的液体，收集碎表皮条。

将碎表皮条放入50 mL 烧杯中，加入适量酶解液I ，22℃，110 rpm 振荡酶解1 h 左右。

用孔径为75 μm 滤膜过滤，收集表皮条，加入适量酶解液II ，22℃，110 rpm 振荡酶解2 h 。

第二步酶解过程中，当在显微镜下观察到显微镜镜检发现视野中保卫细胞变圆成为原生质体，或脱落或以球状挂在气孔厚壁上，这类细胞占到总保卫细胞大约40%时停止酶解。

将酶解液以移液器轻柔抽打几次以利于原生质体的脱落，然后将酶解液用20 μm 滤膜过滤，滤液在100 g 下离心1 min ，移去上部溶液，沉淀部分即为保卫细胞原生质体。

1. 大量保卫细胞的获得为了获得足够的有活力的原生质体，传统的通过撕取表皮酶解来获得原生质体的方法，不能满足某些实验大量需要保卫细胞原生质体的要求，于是，借鉴整片叶片打碎再酶解的方法[20]。

取生长四周的拟南芥叶片约200片，4℃冷水中冰浴10 min ，转入含约600 mL 冷蒸馏水的匀浆机中打制约5~6次，速度约为8000~10000 rpm ，时间分别为30 sec/次（图1，A ），然后用75 μm 的尼龙滤膜过滤，冷蒸馏水冲洗后再用基本液漂洗，获得所需要的表皮条(图1，B)。

取约400片拟南芥野生型叶片经过研磨后，经过滤可收集到较为足够的表皮条，呈淡绿色如图1B 。

将所得表皮条转入酶解液I 中(酶液与叶片比例为1 mL:10片)，在22℃，110 rpm/min 的摇床上酶解约1 h ，进行第一步酶解。

同时吸取部分碎表皮条在显微镜下NS FC-RE PORT -2014进行观察，发现表皮密度适中并且表皮上仅带有微量的叶肉细胞（图1，C 、D ），这种方法可以一次性获得大量的碎表皮条，大大提高了实验效率，并且从源头上减少了叶肉细胞量，为后续除去杂质奠定了基础。

图1 研磨后收集到的碎表皮条已有报道提取原生质体试验中，使用的是Cellulase “Onozuka” RS ( Yakult HonshaCo , Tokyo, Japan )纤维素酶，酶解效率高，效果好且酶解时间短，但价格较昂贵。

如需要大量的保卫细胞原生质体，使用该酶成本过高，故选择使用更为经济的Cellulase “ONOZUKA”R -10（Yakult Honsha Co , Tokyo, Japan ）纤维素酶进行酶解。

为达到较为理想的实验结果，我们对酶解液中纤维素酶的浓度、酶解时间进行了摸索，希望通过增加酶解液中纤维素酶的浓度，并适当延长酶解时间来达到较高的酶解效率。

分别选取了酶解液II 中纤维素酶浓度为1.5%，2%，2.5%，酶I 酶解1 h ，酶II 酶解3 h 进行观察和数量统计（图2，表1）。

当酶II 中纤维素酶浓度为1.5%时，原生质体产量为0.44×106个/gFW ，数量很少；纤维素酶的浓度为2%时，原生质体最多，产量为2.12×106个/gFW ；酶浓度为2.5%时，原生质体数量居于两种处理之间，产量为1.94×106个/gFW 。

综合以上实验结果，可见酶浓度增加，游离出的原生质体数量增多。

酶解时间过长，会对细胞膜造成损伤，导致原生质体活力下降甚至破裂。

试验过程中我们发现三种不同浓度的酶处理条件下原生质体形状均不规则，随着酶浓度的增加，悬浮液中原生质体破裂严重，酶浓度为2.5%时，原生质体产量相对降低，细胞碎片增加（图2，C ），推测这种结果为酶II 酶解时间过长所致。

A C DBBA CNS FC-R E PORT -2014图2 不同浓度纤维素酶水解3h 后的保卫细胞原生质体表1 不同酶液浓度对拟南芥保卫细胞原生质体分离的影响酶液组成%（w/v ）酶解时间（h ）酶解温度（℃）原生质体数量（×106个/gFW ）纤维素酶Cellulase “ONOZUKA”R -10果胶酶Pectolyase Y-231.5 0.0075 3220.442.0 0.0075 2.12 2.50.00751.94为获得最优细胞分离条件，我们在原有三种不同酶解浓度条件下，改变了酶II 处理时间，分别设1 h ，1.5 h ，2 h 三个酶解时间进行观察。

显微镜下观察发现，在酶解1 h 时，三种酶浓度下，细胞形状都较为完好（图3B ）。

酶解1.5 h 后，保卫细胞壁松散度，细胞稍有变形，且随着酶浓度的增高，细胞壁松散度增加，纤维素酶浓度为2.5%，偶可见悬浮液中有游离的原生质体出现（图3B ）。

酶II 酶解2 h 时，三种酶浓度条件下，都可见到细胞形状改变，同时可观察到挂在气孔壁上及游离的原生质体，随着酶浓度增加，悬浮液中游离原生质体数目增加(如图3，表2)。

两小时后经离心收集，酶浓度为2.5%时，可分离出较多的、外形圆滑、形状规整的保卫细胞原生质体。

NS FC-R E PORT -2014纤维素酶浓度1.5% 纤维素酶浓度2.0% 纤维素酶浓度2.5%图3 不同浓度纤维素酶及不同时间酶解效果比较表2 不同酶液浓度对拟南芥保卫细胞原生质体分离的影响酶液组成%（w/v ）酶解时间（h ）酶解温度（℃）原生质体数量（×106个/gFW ）纤维素酶Cellulase “ONOZUKA”R -10果胶酶 Pectolyase Y-231.5 0.0075 2220.34 2.0 0.0075 0.972.50.00751.15为了检测方法改进后提取出的保卫细胞原生质体是否具有高的活力，参照FDA 染ABCDENS FC-R E PORT -2014色技术对原生质体进行染色。

FDA 本身无荧光，一旦进入原生质体后，由于受到酯酶分解而产生具有荧光的荧光素。

荧光素不能自由出入原生质膜，因此，在激发光下，有活力的细胞能产生绿色荧光，无活力的原生质体不能分解FAD 无绿色荧光产生，叶绿体发出红色荧光；绿色荧光亮度越高表示活力越强。

吸取部分原生质体进行FDA 孵育。

结果显示，应用改进后的方法提取出的原生质体，约90%发出明亮的绿色荧光（如图4），没有检测到红色荧光，说明提取出的原生质体活力较高，较为纯净，很少有叶肉细胞污染，符合实验要求，可以用于后续实验。

荧光 叠加 透射光图4 原生质体FDA 染色综上所述，通过改变拟南芥材料的培养条件，在两步酶解法的基础上，通过改用更加经济的酶、增加酶浓度及适当延长酶解时间来制备保卫细胞原生质体，获得了一套可以快捷、高效、高纯度大量提取保卫细胞原生质体的方法。

2. 文库获得及筛选利用Clontech 公司的SMART 方法，构建完成酵母cDNA 文库。

文库质量检测结果显示，文库滴度为2.8×106pfu/mL 。

以AtCPK10的基因全长为诱饵，对构建好的酵母文库进行筛选，测序结果经比对分析，结果和起初的预想有所不同：获得的蛋白经测序分析多为持家基因表达产物，利用构建的保卫细胞酵母文库筛选CPK10互作蛋白的方法暂告一段。

（二）利用TAP 技术筛选AtCPK10体内互作蛋白1. 植物表达载体pCAMBIA1307-FLAG-HA-CPK10的构建及酶切鉴定根据拟南芥CPK10基因序列设计引物：F5’-TTTCTAGAATGGGTAACTGTAACGCCTGT-3’和R 5’-TTGGTACCTTAAACAGGAACAGTTTGTCCA-3’。

从质粒SP1300-CPK10中扩增At CPK10基因片段（图5），连接pMD-18T 载体，筛选阳性克隆，并酶切验证，正确克隆经送样测序，将测序结果用拟南芥TAIR （/）网站中BLAST 进行比对，核酸序列无突变，表明At CPK10基因克隆成功。

以Xba I 和Kpn I 连接至pCAMBIA1307-FLAG-HA 载体（图6）。

NS FC-RE PORT -2014图5 目的基因At CPK10扩增结果 图6 pCAMBIA1307-FLAG-HA 载体图谱及基因插入位点将测序正确的克隆，酶切胶回收连目的载体，经菌落PCR （图7A ）挑取能扩增出目的条带的阳性克隆，提取质粒，进行双酶切验证（图7B ），电泳检测结果可见切下的目的基因和线性化的载体条带，表明pCAMBIA 1307-FLAG-HA-CPK10表达载体构建成功。

图7 菌落PCR检测阳性克隆及双酶切验证2. 原生质体瞬时蛋白表达取拟南芥哥伦比亚野生型生长28-32 d 的第三轮伸展的幼嫩叶片，用手术刀切碎，置于原生质体酶解液中，室温缓慢摇动4-6 h ，显微镜下观察原生质体状态，状态圆滑，可自由移动，叶绿体等内容物分布均匀，细胞边缘化较少，无大量破碎状态的原生质体可用于进一步转化。

悬浮原生质体，利用PEG 介导的原生质体转化方法将高纯度高浓度的pCM 1307-FLAG-HA-CPK10质粒（CsCl 2密度梯度离心纯化）转入原生质体中，20℃过夜表达10 h ，分别用FLAG 抗体（图8A ）和HA 抗体（图8B ）进行杂交；western 显影结果表明，通过PEG 介导的原生质体转化可以成功的表达目的蛋白。