实验酵母菌等单细胞微生物生长曲线的测定
1 目的要求
（1）了解酵母菌、细菌等单细胞微生物生长曲线的特点及测定原理；
（2）学习用血球计数板计数法和比浊法分别测定酵母和细菌的生长曲线。

2 基本原理
生长曲线是单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。

测定时一般将一定数量的微生物纯菌种接种到一定体积的已灭菌的适宜的新鲜培养液中，在适温条件下培养，定时取样测定培养液中菌的数量，以菌数的对数为纵坐标，生长时间为横坐标，绘制得到生长曲线。

不同的微生物其生长曲线不同，同一微生物在不同培养条件下其生长曲线亦不同。

但单细胞微生物的生长曲线规律基本相同，生长曲线一般分为延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个时期。

测定一定培养条件下的微生物的生长曲线对科研和实际生产有一定的指导意义。

测定生长曲线时需要对生长的单细胞微生物定时取样计数，对于酵母细胞和比较大的细菌细胞可采用血球计数板计数法计数，亦可采用比浊法计数，但对于小的细菌细胞一般采用比浊法。

比浊法是根据培养液中菌细胞数与混浊度成正比，与透光度成反比的关系，利用光电比色计测定菌悬液的光密度值（OD值），以OD值来代表培养液中的浊度即微生物量，然后以培养时间为横坐标，以菌悬液的OD值为纵坐标绘出生长曲线。

此方法所需设备简单，操作简便、迅速。

血球计数板法是利用一块血球计数板来进行计数的。

血球计数板是一块特制的厚玻璃片，中央平台比两边平台低0.1mm，上有两个被精细刻化为400个小方格的格网，面积为1mm2，加盖盖玻片后即构成0.1 mm3体积的计数室。

血球计数板有两种规格：一种是将1 mm2面积的网格划分为25个大格，每个大格再分成16个小格，既25´16；另一种为16´25。

计数时只需无菌操作将稀释到适宜浓度的菌悬液取一滴从盖玻片一侧渗入到计数室，待静置平衡后于显微镜高倍镜下计数，用下面公式算出菌液中细胞数。

单细胞微生物细胞数/mL=5个中格内细胞数¸5´25（或16）´104´菌液稀释倍数
3 实验材料
3．1 菌种酵母菌和大肠杆菌。

3．2 培养基豆芽汁液体培养基、牛肉膏蛋白胨液体培养基、5倍浓缩的牛肉膏蛋白胨培养液。

3．3 器材 722光电比色计或752紫外分光光度计、血球计数板、灭菌移液管或滴管。

4 实验方法与步骤
4．1 用血球计数板法测定酵母的生长曲线
（1）将酵母菌接种到豆芽汁培养液中，28℃振荡培养18h作为种子液备用。

（2）取装有 200mL灭菌豆芽汁培养液的500mL三角瓶2个。

每瓶各接入种子液20mL，28℃振荡培养。

（3）于接种后的第0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、28、32、36、40、44、48h分别用无菌移液管从发酵三角瓶中取样1mL，用血球计数板计数。

4．2 用比浊法测定细菌的生长曲线
（1）将大肠杆菌菌种接种到牛肉膏蛋白胨培养液中，于37℃振荡培养18h备用。

（2）调节光电比色计的波长至420nm处，开机预热10～15min。

（3）以未接种的培养液校正比色计的零点（注意以后每次测定均需重新校正零点）。

（4）取装有200mL灭菌牛肉膏蛋白胨培养液的500mL三角瓶六个，分为两组，第一组三瓶中各接种20mL的大肠杆菌种子液，于37℃振荡培养，分别于0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24h取样，以未接种培养液调零，在光电比色计上比色。

测定各样品的OD值。

第二组三瓶区别第一组的是在接种培养6h后，无菌操作加入浓缩5倍的已灭菌的牛肉膏蛋白胨培养液20mL，摇匀后继续培养。

同样条件培养后同样时间间隔取样测定OD值。

5 实验结果
将实验结果填入下表
培养时间（h）0 1
.5
3 4 6 8 1
1
2
1
4
正常生长OD
值
补料培养OD
值
（1）以培养时间为横坐标，菌数的对数值为纵坐标，绘出酵母菌的生长曲线图。

（2）以培养时间为横坐标，大肠杆菌菌悬液的OD值为纵坐标，绘出大肠杆菌在正常生长和补料培养两种条件下的生长曲线。

6 注意事项
用血球计数板计数时菌液太浓时需作适当稀释后计数，稀释倍数一般不超过100倍。

7 思考题
（1）比较酵母和细菌生长的曲线图。

（2）比较大肠杆菌在正常生长和补料培养两种条件下的生长曲线图有何不同？。