LLE方法操作实例
操作实例
萃取剂
LLE方法操作实例
待测药物：氯雷他定
内标：地西泮
LLE方法总结
优点
➢选择性高，可除去大部分杂质 ➢对有机溶剂蒸发后复溶，可以对样品进行浓缩 ➢样品较干净，对仪器污染小 ➢不同PH体系中与不同的萃取剂组合，可控制回收率，并降 低基质效应
缺点
➢操作繁琐，不能自动化 ➢易乳化 ➢一般提取回收率较低 ➢不适用于极性大或者易挥发的化合物的提取 ➢由于需要挥发有机溶剂，对于热不稳定的化合物也不太适合， 容器吸附的化合物也有一定的困难
生物样品的储存
一、冷藏或冷冻
➢采样后除了立即分析外，为防止药物发生变化，应： 短期保存，可4℃冷藏 长期保存，可-20℃冷冻，不要反复冻融（大部分药物） -80℃，阿莫西林等抗生素
二、有时，还应考虑加入稳定剂
➢酶抑制剂：一些酯类药物，如普鲁卡因、阿糖胞苷，易受 血浆酯酶作用而发生水解，而应在采样后立即加入酶抑制剂 如氟化钠。 ➢抗氧化剂：一些易氧化的物质，可加入VC或其它氧化剂。 如血浆中的儿茶酚类药物常规保存仅4周，若加入适量的VC， 则能保存10周。
常用中性盐种类
•饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐、枸橼酸盐
操作实例
•血清和饱和硫酸铵的比例为1:2，混合，离心10000r/min 1-2min， 即可除去90%以上蛋白质
生物样品常用的性质和测定方 法三个方面的问题：
一
二
三
沉淀蛋白 (PPT)
液液萃取 (LLE)
固相萃取技术基本原理和方法
基本原理
➢采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、 纯化，是一种包括液相和固相的物理萃取过程；也可以将其近 似地看作一种简单的色谱过程
基本方法
➢较常用的方法是使液体样品通过一吸附剂，保留其中被测物 质，再选用适当强度溶剂冲去杂质，然后用少量良溶剂洗脱被 测物质，从而达到快速分离净化与浓缩的目的 ➢也可选择性吸附干扰杂质，而让被测物质流出
吸附型萃取
➢采用极性较强的硅胶、硅藻土和氧化铝等吸附剂
固相萃取和HPLC相比的特点
➢ SPE也是一个柱色谱分离过程，分离机理、固定相 和溶剂的选择等方面与高效液相色谱（HPLC）有许多 相似之处。
➢ 但是SPE柱的填料粒径（>40µm）要比HPLC填料 （3~10µm）大。由于短的柱床和大的粒径，SPE柱效 比HPLC色谱柱低得多。
生物样品的储存和预处理 (添加酶抑制剂)
体内胆碱酯酶的 作用下缓慢代谢
盐酸班布特罗（前药）
阻断水解 特布他林（代谢产物）
毒扁豆碱 (胆碱酯酶抑制剂）
生物样品的储存和预处理(避光）
生物样品的储存和预处理 (PH值和温度）
生物样品预处理目的
1
2
3
➢将药物从缀 合物（尿）或 结合物中释放 出来，以测定 药物浓度
缺点
➢只适用于样品中浓度较高的药物测定； ➢样品处理后仍然存在很多干扰物质，对结果产生干扰； ➢残余的杂质会堵塞色谱柱，污染仪器
加入强酸
原理
➢当PH低于蛋白质等电点时，蛋白质以阳离子形式存在，加入强酸， 可与蛋白质阳离子形成不溶性盐沉淀。
常用有机溶剂种类
•10%三氯醋酸， 10%高氯酸等
经验总结
➢血清与强酸的比例为1:0.6混合，高速离心，就可除去蛋白质 ➢在酸性条件下分解的药物不宜本法除蛋白
Oasis HLB柱（聚合物基质）
Oasis HLB柱（聚合物基质）
➢亲水亲脂柱的优点
•亲水基团（吡咯烷酮基团）和疏水基团（二 乙烯基苯）,对极性化合物和非极性化合物均 有较好的保留，具有亲水亲脂平衡的特性 •具有水可润湿性，填料经活化后，即使柱床 干涸，吸附剂对目标物的保留也不会发生变化 •有机聚合物而非硅胶，在pH 0-14 的范围内 表现稳定 •有机聚合物基质的吸附剂，不存在次级相互 作用，用于碱性化合物能够得到满意的结果
生物样品常用的处理方法
主要考虑生物样品的种类、被测药物的性质和测定方 法三个方面的问题：
一
二
三
沉淀蛋白 (PPT)
液液萃取 (LLE)
固相萃取 (SPE)
固相萃取技术(SPE)
固相萃取(Solid Phase Extraction，简称SPE)是从
八十年代中期开始发展起来的一 项样品前处理技术。由液固萃取 和液相色谱技术相结合发展而来。 主要通过固相填料对样品组分的 选择性吸咐及解吸过程，实现对 样品的分离，纯化和富集。主要 目的在于降低样品基质干扰，提 高检测灵敏度
平衡
上样
淋洗
洗脱
基质 杂质 目标化合物
常见的固相萃取柱
➢普通C18固相萃取 •固相萃取材料耐受PH范围窄（2-7.5） •硅胶键合吸附剂的表面存在未键合的硅羟基，对碱性化合 物的保留较强，用硅胶键合吸附剂处理碱性化合物，回收率 通常较低 •对极性化合物保留差
➢HLB(Hydrophilic-lipophilic Balance Copolymer) •PH1-14范围内稳定 •无裸露的硅醇羟基 •亲水物质和亲脂物质具有均衡的保留能力，覆盖了非极性、 弱极性、极性化合物
Oasis HLB柱（聚合物基质）
离子交换与反相模式 混合的固相萃取
离子交换 反相作用
•强阳离子和反相双重保留基质 •常用于提取净化生物基质中的 弱碱性化合物 •酸性环境中含氮碱性基团与磺 酸基结合 •酸性药物呈分子状态发生反相 结合作用
离子交换与反相模式 混合的固相萃取
固相萃取法方法总结
SPE优点：
➢将微量药物 从复杂介质中 纯化、富集起 来
➢防止分析仪 器的污染，提 高测定灵敏度 和选择性
生物样品常用的处理方法
主要考虑生物样品的种类、被测药物的性质和测定方 法三个方面的问题：
一
二
三
沉淀蛋白 (PPT)
液液萃取 (LLE)
固相萃取 (SPE)
沉淀蛋白
通过沉淀蛋白质可以使结合的药物释放出来，达到对待测组分的 提纯和纯化
奥氮平
有机溶剂沉淀法
经验总结
➢血浆或血清与有机溶剂的体积比为1:1~3，就可以将90%以上的蛋白质 除去，采用低温低速3500r/min离心10min便可将析出的蛋白质完全沉淀。
优点
➢操作简单，快速，精密度好，为方法开发中优先考虑使用的，特别在 LC-MS方法中 ➢几乎使用于所有小分子化合物，无论其极性大小 ➢化合物回收率接近100%，几乎所有小分子化合物都被提取，尤其适用 于代谢产物鉴定
基质效应及其影响
基质效应（martix effect）：
➢定义：样品测试过程中，由于待测物以外的的其它 物质存在，直接或间接影响待测物相应的现象 ➢如测定血液中的红霉素浓度为例，除了红霉素之外 的蛋白、磷脂、及其它内源性物质为基质 ➢共流成分会改变待测化合物的离子化效率，引起对 待测化合物监测信号的抑制或提高
生物样品种类
均匀生物样品
血液（全血、血浆、血清） 尿液、唾液、胆汁、乳汁、 脑脊液、淋巴液、汗液等
非均匀生物样品
心、肝、肾、脾、肺、脑、 胃、肠、子宫、肌肉、皮 肤等组织、器官
全血
全血
➢全血包括液体成分的血浆和分 散悬浮于其中的血细胞 ➢全血不易保存，且血细胞中含 有很多干扰物质，影响测定， 故较少用全血测定药物浓度。 ➢仅用于血浆药物浓度太低或者 血浆药物浓度波动较大，且难 以控制的药物，如环抱霉素A。
有机溶剂 沉淀法
加入中 性盐
有机酸
加入锌盐 或铜盐沉
淀剂
酶解法
有机溶剂沉淀法
原理
➢加入水溶性有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化
常用有机溶剂种类
•乙腈、甲醇、丙酮、乙醇、四氢呋喃等
操作实例
50μl 血浆+150μl甲醇 取上清液进样分析
涡旋1min
3500rpm离心10min
有机溶剂沉淀法实例
生物样品前处理
制作人：叶超
目录
1 生物样品种类 2 生物样品储存 3 生物样品预处理 4 克服基质效应方法
Distribution Metabolism
Absorption Excretion
生物样品中药物的分析测定是定量描述药物体内过程、 获得药代参数的重要手段之一
体内生物样品分析特点
体内生物样 品分析特点
固相萃取 (SPE)
液-液提取方法（LLE）
原理 ➢药物在体内吸收，需经跨膜转运，所 以多数药物具有一定脂溶性 ➢生物样品中大多数内源性杂质是强极 性的水溶性物质
可以根据药物分子与基质之间的极性差异，使用适 当的有机溶剂提取药物，可一次性除去大部分杂质
LLE方法需是考虑的问题
一、溶剂的选择原则
常用液-液萃取溶剂
固相萃取分离类型
反相固相萃取
➢硅胶上键合C18，C8，C2，苯基，腈基 ➢流动相极性大于固定相，适合分离中小极性的化合物的萃取 ➢疏水性相互作用
正相固相萃取
➢无键合硅胶、或硅胶上键合氰基、NH2、二醇基 ➢流动相极性小于固定相，适合于极性的化合物的萃取 ➢亲水性相互作用
离子交换萃取
➢硅胶基质的离子交换官能团，季胺，氨基、二氨基、苯磺酸基、羧基 ➢带有电荷的化合物靠静电吸引到带有电荷的吸附剂表面
血浆
血浆
➢将采取的血液置含有抗凝剂 （如肝素、EDTA)的试管中，混 合后，3000-4000r/min离心，分 离红细胞，上清液即为血浆。 ➢测定血中药物浓度通常是指测 定血浆或血清中的药物浓度，而 不是指含有血细胞的全血中 的 药物浓度。
血清
血清
➢血清是采血后不加任何抗凝剂， 于室温下静置15-30min，待其自 然凝结后，离心，分离出上清液。 ➢血清较血浆颜色更浅，较血浆 少了大部分纤维蛋白，更易进行 处理，且血浆及血清中的药物浓 度测定值通常是相同的。