淀粉酶活性的测定
植物中的淀粉酶能将贮藏的淀粉水解成麦芽糖。
淀粉酶几乎存在于所有植物中，其中以禾谷类种子的淀粉酶活性最强。
植物中有α–淀粉酶和β–淀粉酶，其活性因植物的生长发育时期不同而有所变化。
通过本实验掌握淀粉酶的提取和测定方法。
一、原理
α–淀粉酶和β–淀粉酶，各有其一定的特性，如β–淀粉酶不耐热，在高温下易钝化，而α–淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下则发生钝化。
通常提取液中同时有两种淀粉酶存在，测定时，可根据它们的特性分别加以处理，钝化其中之一，即可测出另一酶的活性。
将提取液加热到70℃维持15 min以钝化β–淀粉酶，便可测定α–淀粉酶的活性。
或者将提取液用pH3.6之醋酸在0℃加以处理，钝化α–淀粉酶，以求出β–淀粉酶的活性。
淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3，5–二硝基水杨酸试剂测定。
由于麦芽糖能将后者还原生成3–氨基–5–硝基水杨酸的显色基团，在一定范围内其颜色的深浅与糖的浓度成正比，故可求出麦芽糖的含量。
以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。
二、实验材料、试剂与仪器设备
（一）实验材料
萌发的小麦（芽长1 cm左右）。
（二）试剂
1. 1％淀粉：称取1.0g淀粉溶于100mL 0.1mol/L pH 5.6的柠檬酸缓冲液中。
2. 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液：A液：称取柠檬酸20.01 g，溶解后稀释至l000 mL；B液：称取柠檬酸钠29.41 g，溶解后稀释至1000 mL。
取A液55 mL与B液145 mL混匀，即为pH5.6之缓冲液。
3. 3, 5–二硝基水杨酸溶液：精确称取3, 5–二硝基水杨酸1 g溶于20 mL 2 mol/L氢氧化钠中，加入50 mL蒸馏水，再加入30 g酒石酸钾钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100 mL，盖紧瓶塞，勿使二氧化碳进入。
4. 麦芽糖标准液：称取麦芽糖0.100 g溶于少量蒸馏水中，仔细移入100 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。
（三）仪器设备
小台秤，研钵，容量瓶100 mL，具塞刻度试管，试管，刻度吸管l mL 2 mL 10 mL，离心机，恒温水浴，分光光度计。
三、实验步骤
1. 酶液的提取称取1.0 g萌发的小麦种子，置研钵中加2 mL蒸馏水和少量石英砂，研磨成匀浆后转入离心管中，用7mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管，提取液在室温下放置提取15～20 min，每隔数分钟搅动1次使其充分提取。
然后在3000r/min转速下离心10 min，将上清液倒入50mL容量瓶中加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液。
吸取上速淀粉酶原液5mL，放入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度摇匀，即为淀粉酶稀释液。
2．麦芽糖标准曲线制作取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表35–1加入试剂：
表35–1 制作麦芽糖标准曲线配方表
试剂管号
1 2 3 4 5 6 7
麦芽糖标准液（mL）0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
蒸馏水（mL） 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0
麦芽糖含量（mg）0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
3，5-二硝基水杨酸（mL）2 2 2 2 2 2 2
摇匀，置于沸水浴中煮沸5 min。
取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20mL。
以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定。
以麦芽糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
3．酶活力的测定取6支干净的具塞刻度试管，编号，按表35–2进行操作。
表35–2 酶活力的测定配方表
操作项目管号
Ⅰ-1 Ⅰ-2 Ⅰ-3 Ⅱ-1 Ⅱ-2 Ⅱ-3
淀粉酶原液（mL） 1.0 1.0 1.0 0 0 0
钝化β-淀粉酶置70℃水浴中15 min，取出后在流水中冷却
淀粉酶稀释液（mL）0 0 0 1.0 1.0 1.0
DNS试剂（mL）2.0 0 0 2.0 0 0
预保温40℃恒温水浴保温10 min
40℃1%淀粉溶液（mL）1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
保温40℃恒温水浴中准确保温5 min
DNS试剂（mL）0 2.0 2.0 0 2.0 2.0
摇匀，置于水浴中煮沸5 min,取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20mL。
摇匀，在540nm 波长下比色，记录光密度值，从麦芽糖标准曲线中查出麦芽糖含量，用以表示酶活性。
四、结果计算
α–淀粉酶总活性[麦芽糖（mg）/(g•min)]
(α +β)–淀粉酶总活性[麦芽糖（mg）/(g•min)]
式中：A——α–淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖（在标准曲线上查得值），mg。
A′——α–淀粉酶的对照管中麦芽糖量，mg。
B——(α +β)–淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖量，mg。
B′——(α +β)–淀粉酶的对照管中麦芽糖量，mg。
V——测定时所用样品液体积，mL。
t——酶作用时间，min。