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五、胚胎移植
---胚胎工程的最后一道工序 将受精卵或发育到一定时期的早期胚胎,移植 到受体动物生殖管道的一定部位,能在子宫内着 床、生长、发育、分娩、出生仔代动物的技术称 为胚胎移植。
几乎所有的胚胎工程技术在体外完成对胚胎的 操作后，都需经过胚胎移植这一步骤，得到我们 所要的动物。
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体外培养的胚胎必须移植到同步发情的雌性动物 生殖管道内。解决同步发情的方法有两种： 1.利用自然同期发情的母畜，此法在实践上较难办 到； 2.通过注射某些药物(如孕激素、雌激素等)诱发同 期发情。 不同发育阶段的胚胎移植的部位不同。受精卵和 2细胞胚胎应移植到输卵管内，而桑椹胚和囊胚期 胚胎应移植到子宫内，以跟正常妊娠生殖生理变 化同步。
5.胚胎培养
6.胚胎移植 7.胚胎冷冻保存 二、体细胞克隆技术 三、干细胞技术 四、外源基因导入技术
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胚胎工程的应用
1．在畜牧业方面：通过建立超数排卵、受精卵/卵母 细胞的采集、体外受精、胚胎切割、胚胎性别控制、体 细胞克隆以及胚胎移植技术，加快良种家畜的繁殖和家 畜品种的改良。
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2．在生物制药方面：通过转基因技术将具有药用价值的 生物活性蛋白的基因整合到宿主的染色体上，使其在 乳汁、血液、尿液等体液中表达。通过收集、纯化这 些体液中的生物活性蛋白，用于预防和治疗某些人类 的疾病。
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核移植（Nuclear transfer）是指将动物细胞的 细胞核移植到另一个体的去核卵母细胞胞质中，通 过电激活，使供体核重编程序，形成的重构卵发育 成胚胎，最后通过胚胎移植，使之发育成个体。 如果受体去核卵和供体移入的核来自同种动物， 则称种内核移植，来自不同的种则称为种间核移植。 核移植由于没有经过精子和卵子的受精过程，核移 植动物的全部遗传信息来自供体核细胞，等于是复 制了提供细胞核的动物，因而把它俗称为“克隆”。
从输卵管壶腹部取卵母细胞/受精卵的方法 10
3.超数排卵（Superovolation）技术：
通过注射激素刺激卵巢大量排卵。经超数排卵处理，动物 卵巢大量的卵泡同时成熟并排出，排卵数可增加几倍至十 几倍，一次可获得大量的卵细胞、受精卵或早期胚胎。 所用激素有促卵泡激素（FSH）、人绒毛膜促性腺激素 (HCG)和孕马血清促性腺激素（PMSG）、孕酮和前列腺素 （PG）等，以前三种常用。
正常人染色体
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具体的做法是： •先用DNA特异性染料对 精子进行活体染色，然 后精子连同少量稀释液 逐个通过激光束。探测 器根据精子的发光强度 把电信号传递给计算机， 计算机指令液滴充电使 发光强度高的液滴带正 电，弱的带负电。即X 精子带上正电荷，Y精 子带上负电荷。当经过 高压电场时会向不同方 向偏转，达到分离的目 的。
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三、胚胎性别控制
性别控制的研究，是畜牧业生物技术中一项重要的高 新技术。这项技术的应用，可以使畜牧上大动物的繁殖按 照人们的意愿只生产同一性别动物。 • 在医学上，性别控制的研究也具有积极的意义。有的遗 传性疾病属于性连锁遗传，例如进行性肌营养不良，为X 连锁隐性遗传，男性发病，女性携带异常基因但不发病。 携带此致病基因的女性怀孕后如做胚胎性别鉴定，则可避 免男性患儿的出生。
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六、胚胎冷冻保存
胚胎冷冻保存（embryo cryopreservation）技术 是指在低温（-196℃液氮内）条件下利用低温保护 剂保存生殖细胞及胚胎的一门技术。
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（一）胚胎冷冻保存的机制 低温降低了胚胎内的生化反应速度。并且温度越低，保 存时间就越长。 低温损伤：如果冷却速度过慢，胞外溶液中水分大量结 冰，溶液浓度提高，胞内水分大量渗出，导致细胞的强烈收 缩和细胞处于高浓度的溶液中时间过长，从而造成化学损伤； 如果冷却速度过快，胞内水分来不及通过细胞膜向外渗出， 胞内溶液过冷而结冰，从而造成物理损伤。 同样，在复温（解冻）过程中，如果复温速率不当也可能 引起细胞内结冰（重结冰）而损伤。
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注射PMSG
注射hCG
24小时
检查阴栓： 妊娠0.5天
20小时
24小时
受精卵 中午12时
中午12时 上午8时
放到种公鼠笼内 注射PMSG
24小时 24小时
注射hCG
15小时
采 集
卵母细胞
晚上5-6时 晚上5-6时
小鼠超数排卵程序
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二、体外受精
体外受精（In vitro fertilization）是指成熟精子与卵母细胞在体 外环境下完成受精的过程。这一过程包括卵母细胞的收集或未成熟卵母 细胞的培养成熟、精子的获取、获能处理、受精及受精后胚胎培养等。 体外受精联合胚胎移植技术（IVF）又称试管婴儿。
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胚胎工程（Embryonic engineering）又称胚胎技术,是指用工程学的原理对 动物的胚胎进行某种技术操作或改造，使之获得人们所需要动物的一系列生 物技术的总称,包括以下四大技术体系：
一、胚胎操作基本技术
1.超数排卵和卵母细胞、精子、受精卵的采集
2.体外受精 3.胚胎性别控制 4.胚胎分割
5．在拯救濒危野生动物方面：通过野生动物生殖 细胞和组织的冷冻保存、体细胞克隆和胚胎移植 技术，扩大野生动物的种群。
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第二节
胚胎操作基本技术
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胚胎操作的整个过程局限在胚胎的早期发育
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一、精子、卵母细胞、受精卵的采集和超数排卵
1.精子的采集 啮齿类小动物精子的采集大都从体成熟雄性动物的附睾获取。将动物 处死后，分离附睾尾部，用眼科剪子在顶端剪一小口，用手指轻柔挤出 浓稠的液滴，置培养液中培养。 大动物的精液采集可采用假阴道或电刺激方法促进雄性射精，收集精 液。
已在乳腺表达的生 物活性蛋白并进入 临床2期或3期试验： 抗凝血酶一Ⅲ 抗胰蛋白酶
蛋白C
乳铁蛋白 乳糖酶
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3．在医学方面：通过建立卵母细胞的采集、体外 受精、显微受精以及胚胎移植技术，用于不孕症 的治疗；通过对胚胎培养和检测，剔除具有遗传 性疾病的胚胎，达到优生优育的目的。
4．在生命科学研究方面：阐明哺乳动物早期胚胎 发生、发育机制等基础理论
⒊ 应用于实验动物的生物净化。 ⒋ 应用于实验动物育种和野生动物的实验动 物化。
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第三节
动物体细胞克隆技术
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克隆（clone）的概念 克隆是指无性繁殖或拷贝。 无性生殖在植物中很常见，在动物中过 去认为是不可能的。
动物克隆是指生物体通过体细胞核移植 生产出基因型几乎与供体完全相同的后代。
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同一种属内的不同品 种品系可互相进行胚 胎移植。如近交系 C57BL/6J小鼠的胚胎 可移植到雌性封闭群 ICR的生殖管道内； 日本大耳白兔的胚胎 可移植到雌性新西兰 兔的生殖管道内。这 一特点在畜牧业特别 有用，如为了加快良 种奶牛的繁殖，可将 良种奶牛的胚胎移植 到普通黄牛的生殖管 道内，借腹怀胎。
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四、胚胎培养
胚胎培养是指将获得的早期胚胎在体外人工环境中进 行培养，以观察其发育或人工干预某一发育过程的可能性。
受精卵
2细胞胚
4细胞胚
8细胞胚
桑椹胚
囊
胚
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胚胎培养一般应用于以下几个方面： 1．未成熟卵母细胞通过体外培养，成熟后进行体外受精。 2．受精卵通过体外培养发育成各阶段的早期胚胎，用于胚 胎移植或胚胎冷冻保存。 3．冷冻保存胚胎解冻后，通过体外培养，筛选成活胚胎用 于胚胎移植。 4．通过研究胚胎发育的环境和条件，不断完善胚胎培养条 件，揭示胚胎细胞的生长发育和分化的奥秘。 目前胚胎培养技术已经可以将未成熟卵在体外成熟，并 通过体外受精发育成各阶段的早期胚胎。即使如此，在体外 胚胎培养也只能发育到囊胚期，需要在囊胚期前移植到动物 的子宫内。
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诱导性多潜能干细胞” (Induced pluripotent stem cells, iPS 细胞) 2006 年, Takahashi 等首次发现导入特定的转录因子基 因能够使已分化的细胞重编程回归到胚胎细胞状态。他们 通过慢病毒载体介导将Oct4、Sox2、c-Myc 和Klf4 4 种 转录因子基因导入小鼠皮肤成纤维细胞, 获得了具有强大 的自我更新能力和分化潜能的多能性干细胞, 命名为“诱 导性多潜能干细胞” (Induced pluripotent stem cells, iPS 细胞)。这一研究克服了ES细胞和AS细胞应用 存在的诸多问题，展现了广阔的应用前景，受到了整个生 命科学领域的广泛关注。目前研究中较为理想的供体细胞 主要有血细胞(如T 细胞和B 细胞等)、脂肪细胞和皮肤成 纤维细胞。
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（二）对胚胎进行鉴定以控制性别 在胚胎移植前对胚胎的部分组织用染色体检查、 间接免疫荧光法和PCR法进行性别鉴定。其中PCR法 因有可靠的操作程序，具有高效、快速的特点，近 年来得到迅速的发展。 Y染色体短臂上有决定雄性的DNA片段-SRY基因 (sex-determining region of Y-chromosome,全称:Y 染色体性别决定区)，为胚胎性别鉴定提供了可靠 的途径。
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性别控制技术 1. 通过对X精子与Y精子分离以控制性别
2. 在胚胎移植前对胚胎的性别进行鉴定以控制性 别
3. 通过控制饲料特性、受精环境如改变精液或阴 道的PH值等来控制性别。
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（一）分离X精子与Y精子以控制性别 分离X精子与Y精子的依据：X、Y精子在体积、 密度、电荷、运动性和DNA含量、表面抗原等方面 存在差异。将X和Y精子分离再通过人工授精可以 有效地达到性别控制的目的。
第十二章 实验动物胚胎工程技术
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第一节
概述
工程:通过构想、设计，按照人们的意愿制作、改造某一事物，以达 到预想的目的。 生物工程：
按照工程学原理，对生物体或生物大分子进行改造或利用，用于生 产、研究、检定和创造新物种的综合性科学技术。 遗传（基因）工程 蛋白质工程 分子水平 酶工程 细胞工程 微生物工程 细胞水平 胚胎工程 组织工程 组织水平