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实验室诊断
病原学样品
•抗凝血 •淋巴结 •脾脏 •肾脏 •骨髓
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实验室诊断的安全原则
• 保障人员的安全
– 穿戴：眼罩、手套、实验服、口罩和鞋套等
– 行为：洗手、禁止聊天，实验室内禁止食用食 物和饮料等
– 了解化学试剂的特性和潜在的危险
• 保障样品的安全
– 防止样品交叉污染 – 一次性手套
GLP (good laboratory practice)
• 原则
制定一整套标准以确保质量、可靠性和完整性， 可 核查结论和可追溯性数据的报告。
• 要点
– 资源：组织、人员、设施和设备
– 特征：检测项目和测试系统
– 规则：试验步骤、标准操作程序（SOP）
– 结果：原始数据、最后报告和档案
– 质量保证：独立监测的研究过程
临床诊断
各种毒力的毒株均可导致流产
•胎儿可能全身水肿 •胎盘、皮肤、心肌或肝脏可能有淤血点
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➢病理诊断
诊断
脾脏 肿大 易碎
暗红色至黑色
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胃、肝、肾各部位淋巴结肿 大、出血；
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水肿
➢肺、肝、膀胱 ➢胆囊充盈 ➢结肠系膜
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出血
➢瘀点 ➢瘀斑
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肾皮质出血点、出血斑
肺部局部肉芽肿，形成结节
➢ 可疑样品：当样品的Ct值大于35小于37并且扩增曲线 呈指数时被判定为可疑，当扩增曲线呈线性时判为阴 性。可疑样品应当重新提取病毒核酸检测，如仍为可 疑，可判为阳性。
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实时荧光RPA
• 重组酶聚合酶扩增技术 • 等温扩增（37~42°C） • 用时短：20分钟 • 灵敏度高 • 操作简单，便携式仪器
非洲猪瘟实验室诊断
African Swine Fever, ASF
国家外来动物疫病研究中心 中国动物卫生与流行病学中心
定义
非洲猪瘟是家猪、疣猪、欧洲野猪和美洲野猪的一种传 染性极强的出血性疾病。所有年龄的猪都易感。 ——世界动物卫生组织
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• 可表现为最急性、急性、亚急性和慢性四 种形式
• 严重程度与毒株、猪种及流行时间的长短 有关
双抗体夹心ELISA测 定ASFV抗原
实验室诊断
血清学
间接ELISA测定ASF 特异性抗体
阻断ELISA检测ASF 特异性抗体
免疫印迹
间接免疫荧光测抗体
唯一确诊单位：国家实外用来文档动物疫病研究中心
实验室诊断
血清样品
×
合 格 血
液 样 品
析 出 的
血
不合格血液样品
清
分离好的血清单独 包装，并一一编号
图9：肾淤斑及出血点（急性） 图10：肾盂及肾乳头部的 出 血斑（急性）
图11：肾盂处散在的出血点（急性ASF ） 图12：肿大、出血的肝胃淋实巴用结文，档 可出见有血凝块。（急性）
图13：肝胃淋巴结切面，肿大并呈暗红色。（急性ASF） 图14：心包积液及心包肌层有散在的出血点。（急性ASF）
图15：胆囊水肿（急性ASF） 图16：肺部可见肉芽肿病变， 实用文档 形成一结节（慢性ASF）
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口蹄疫病毒原
➢特点之二：基因多变
基因组两端各有一个高变区，基因型多达 22个
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病原
➢ 特点之三：抵抗力强
温度：
60℃ 20分钟；
56℃ 70分钟
25-37 ℃ 数周
4℃
>1年
冻肉 数年到数十年
乙醚、氯仿等脂溶剂可破坏囊膜使其失活
pH：
4——11.5 无血清 4——13.4 有血清 未熟肉品、腌肉、泔水中可长时间存活
–非洲猪瘟病毒科中唯一成员
– Asfarviridae Asfivirus ASFV
–兼具虹彩病毒和痘病毒的某些特性 –唯一核酸为DNA的虫媒病毒 –只有一个血清型
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病原
➢ 特点之一：基因组大
蓝耳病病毒 15kb 12 倍
170~190 kb
猪瘟病毒 12kb 15 倍
Genome CSFV
• 将500 µl冲洗缓冲液（蓝盖）加入过滤管，以8000 g进行1分 钟离心操作。
• 扔掉收集管，重复冲洗步骤（500 µl冲洗缓冲液加入过滤管 ，以8000 g进行1分钟离心操作）。
• 扔掉收集管，将过滤管放入干净的收集管中。以13,000 g进 行10s离心操作以去除残余的冲洗缓冲液。
• 扔掉收集管，将过滤管放入实干用文净档的1.5 ml微离心管中。
African swine fever--comparative study of available tests. Virus research 173:150-158.
荧光PCR检测病毒DNA 实用文档
荧光PCR工作单
样品的可追溯性！
2017/5/1 5
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荧光PCR检测病毒DNA-试剂准备
提取病毒DNA （3）
• 将50 µl—100 µl预热的消毒蒸馏水加入过滤管 （ 注意不要使用试剂盒中Elution buffer），以 8000 g 进行1分钟离心操作。
• 将DNA溶液在<-10ºC温度下储存（有效期：12个 月），备用；如果DNA溶液在1-2小时内用于PCR 操作，在4±3ºC温度下短暂储存，然后冻存。
图17：肺实变区（慢性ASF）
图18：心包脏层附有纤维素， 而且可见出血点（慢性ASF）
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鉴别诊断
• 高致病性蓝耳病 • 猪皮炎肾炎综合征（PDNS）由PCV-2引起 • 细菌性败血症 • 香豆素中毒 • 真菌毒素中毒 。。。。
2017/5/1 5
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ASF感染的主要特征
猪 (野猪和家猪) 软蜱
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临床症状
➢最急性型
➢急性型
➢亚急性型
➢慢性型
2017/5/1 5
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临床诊断
最急性型
•无临床症状，突然死亡
急性型（强毒株）
• 发烧（41-42°C） • 食欲减退 • 不愿活动 • 局部皮肤变红或变蓝色 • 腹泻 • 呕吐 • 呼吸困难 • 流产 • 死亡率高（10-100%）
实用仔M文i猪tya发档na生, AUSgaFn，d耳a, 、20鼻10、唇、腿发红，神经症状，数小时内死亡。
➢病毒DNA提取试剂盒 ➢非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒
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荧光PCR检测病毒DNA-试剂制备
➢冻干蛋白酶K: 将蛋白酶K溶解在4.5 ml灭菌后的
蒸馏水中，将溶液以500 µl分装，在 <-10ºC温度下 储存，直到使用。
➢除抑制物缓冲液: 将20
ml无水乙醇加
入原始小瓶 中混匀并进行相应的标记和日期记录。
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荧光PCR检测病毒DNA—OIE方法
配制反应体系： ➢反应液溶解后，每个反应管中加入18 µl反应液， 然后再加入2 µl模板； ➢每次试验需设立反应阳性对照（R+，绿管中的反 应阳性对照）和反应阴性对照（R-，灭菌水）
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荧光PCR检测
程序设置
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荧光PCR检测病毒DNA-实验结果 实用文档
感染
表现出临床症状
携带者
Virus A
病毒血症: 感染后2-3天到b8天，持续很长时间（数月） 特异性抗体: 从感染后
的7-11天至数月，甚至数年 排毒:从 感染早期（第2天）以后实持用续文很档长时间。甚至康复后。
实验室诊断
病原学
病毒分离— 血细胞吸附试验 直接免疫荧光法
（FAT）
普通PCR和荧光定量 PCR
荧光PCR检测病毒DNA-结果判定
➢ 有效性：提取阳性对照（E+）和反应阳性对照R+的 Ct值应小于35，且提取阴性对照（E-）和反应阴性对
照（R-）无Ct值，则试验有效。
➢ 阳性和阴性：当样品的扩增结果有典型的扩增曲线且 Ct值小于37时可判定为阳性。当样品的扩增结果在背
景信号之下或Ct值≥37时，判定为阴性结果。
• 急性型以高热、食欲废绝、皮肤发绀、网 状内皮系统出血为特征，发病后2-10天内 死亡，病死率可高达100%
• 临床上，与古典猪瘟非常相似，难以区分 • 目前没有疫苗！！！
2017/5/1 5
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• 只感染猪 • 家猪和欧亚野猪非常易感
– 感染后存活的猪可能变为无症状的携带者
• 非洲的野生宿主能持续感染很长时间并且 没有临床症状
g或2000 rpm离心10分钟取上清
➢全血（抗凝血）或血清
直接吸取200 µl
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提取病毒DNA
• 将200 µl结合缓冲液（绿盖）和40 µl蛋白酶K（20 mg/mL）加入到1.5 ml离心管中。 • 加入200 µl样本。每个提取程序都加入E+ 和 E-
(200 µl水)对照。 • 立即混匀并在72±2ºC 温度下孵育10分钟。 • 将1.5 ml微离心管简单离心操作，除去管盖内部的
2017/5/1 5
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良好的工作区域
• 第一步
– 实验前清洁试验区域（台面、移液器等） – 注意消毒剂的期限
• 第二步划分不同的区域
– 样品处理（BSL-3提取病毒DNA） – PCR检测（Mix配制、加DNA、扩增等） – ELISA检测区域（加血清、洗涤、终止等）
2017/5/1 5
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水珠。 • 将100 µl异丙醇加入样本试管，混匀。 • 将过滤管放入收集管中，并将样本移入过滤管。
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提取病毒DNA （2）
• 将过滤管以8000 g离心1分钟。如果样本依然留在过滤管中， 重复离心操作。
• 扔掉收集管，将过滤管加入干净的收集管中。