第四章基因文库构建及酵母双杂交技术1 基因组文库的构建基因组文库（genomic library）将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。

理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。

1. 1构建基因文库的载体选用载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。

第四章基因文库构建及酵母双杂交技术1.1.1对载体的要求：载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。

1.1.2目前常用的载体： 载体系列（容量为24 kp ）、cosmid载体（容量为50 kb ）、YAC（容量为1 Mb ）、BAC （容量为300 kb）1.2 基因文库构建的一般步骤1.2.1染色体DNA大片段的制备：断点完全随机，片断长度合适于载体连接。

不能用一般的限制性内切酶消化法，使用物理切割法或不完全酶切法。

1.2.2载体与基因组DNA大片段的连接：直接连接、人工接头或同聚物加尾。

噬菌体载体构建基因组文库第四章基因文库构建及酵母双杂交技术2 cDNA文库的构建cDNA克隆的基本过程是通过一系列，酶酶催作用，使poly(A) mRNA转变成双链cDNA群体并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌寄主细胞，构建包含所有基因编码序列的cDNA基因文库。

2.1高质量mRNA的制备应用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System 分离Poly(A)RNA。

将Biotinylated Oligo(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的Streptavidin，用磁场吸附与PMP相连的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。

PolyAT tract mRNA 的分离纯化过程第四章基因文库构建及酵母双杂交技术2.2反转录成cDNA可同时在反转录系统中加入Oligo(dT)12-18-mer及随机引物R6，以保证得到全长cDNA；应选用活性较高的反转录酶(Reverse transcriptas)；应选用甲基化dCTP；应保证所获得双链cDNA 的方向性。

cDNA克隆时，必须考虑到目的基因mRNA在特定的生物体组织中的含量问题。

根据mRNA分子含量的多寡（丰度），可将其划分为高丰度、中丰度和低丰度三种类型。

寡聚(dT)12-18随机6碱基引物R 6寡聚(dT)12-18随机6碱基引物R 6mRNA (A)n (T)12-18(A)n (A)n(T)12-18R 6R 6R 6R 6R 6R 6第二链合成(A)n(T)12-18(A)n R 6R 6R 6R 6R 6R 6(A)n (T)12-18Eco RI Eco RI 加上EcoRI 接头，磷酸化，cDNA 分级cDNA 合成完毕，准备连接第一链合成cDNA 合成过程示意图第四章基因文库构建及酵母双杂交技术接头及引物序列无RNaseH活性的反转录酶，5’甲基化的dNTPXhoIRNaseH，DNA聚合酶IXhoIEcoRI接头，T4连接酶EcoRI XhoIXhoI酶切XhoI完整有方向的cDNA cDNA合成的分子修饰cDNA文库的构建3 RACE技术cDNA 3′端的快速扩增法（3′RACE 法）(RACE: Rapid Amplification of cDNA Ends)•3`-Full RACE法cDNA 5′端的快速扩增法（5′RACE 法）(RACE: Rapid Amplification of cDNA Ends)5 ’ RACE原理●Self-Ligation 法5’ RACE 法种类1.使用RNA Ligase 的5’ RACE 法●Self-Ligation Method●Adaptor-Adding Method2. 使用TdT (Terminal DeoxynucleotidylTransferase) 的5’ RACE 法Adaptor-Adding Method 原理TdT 法原理几种5’ RACE 法的比较¿É·ñ½øÐNested PCR TdT·¨Öк¬PolyG ²»¿ÉµÍSelf-Ligation·¨ÒýÎïÇé¿öÀ©ÔöÌØÒìÐÔ¸ßÖи߿ÉÌØÒìÐԸߵÍÌØÒìÐԸ߿ÉMethodAdaptor-Adding·¨Á¬½ÓЧÂÊ4 酵母双杂交系统Yeast Two Hybrid System (Interaction trap) 4.1酵母双杂交系统的作用90年代，纽约大学的S. Field等建立。

有效地分离能与一种已知的靶蛋白相互作用的蛋白质4.2酵母双杂交系统的原理4.2.1 结构域（Domain）合作许多真核生物的转录激活因子都是由两个在结构上可以分开的、功能上也相互独立的结构域组成。

例如：啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子GAL4:DNA binding domain Active domain N C1-147aa 768-881aa上游激活序列（UAS ）转录机GAL4效应基因结合结合激活转录只要DNA binding domain （DNA-BD ）与Active domain （AD ）靠近就能够表现转录激活活性。

实验发现：转录表达4.2.2 拆开Domain用重组DNA技术把GAL4的两个Domain分开，就丧失了激活效应基因的能力。

Active domainDNA binding domain结合上游激活序列（UAS）转录机GAL4效应基因不能转录4.2.3 重组Domain用重组DNA 技术把这两个Domain 分别与两个不同的多肽连接。

Active domain 蛋白A蛋白B DNA binding domain 在体内，蛋白A 与蛋白B 是否能结合。

通过效应基因是否被激活来检查：4.2.4 观察报告基因表达上游激活序列（UAS ）转录机GAL4效应基因蛋白ADNA binding domain 转录激活domain蛋白B GAL4的DB domain 与AD Domain 也不能靠近，所以仍然不能启动效应基因的转录。

不能转录（1）如果蛋白A 与蛋白B 不能相互结合上游激活序列（UAS ）转录机GAL4效应基因蛋白ADNA binding domain 转录激活domain蛋白B 激活转录GAL4的DB domain 与AD Domain 也能靠近，所以能启动效应基因的转录。

转录表达（2）如果蛋白A 与蛋白B 能相互结合双杂交原理X基因和Y基因产物的相互结合，导致reporter gene表达。

Reporter gene表达就可说明X基因产物于Y基因产物能结合。

4.3 构建双杂交体系的宿主菌删除基因组中的内源野生型GAL4基因使酵母菌只能利用载体表达的GAL4蛋白。

此外还有其他营养缺陷。

如：SFY526; HF7c 等菌株。

4.4 构建报告基因（reporter gene）GAL4的效应基因是his3/lacZ/URA3。

GAL4激活组氨酸合成酶的表达，使酵母菌能生长在组氨酸缺乏培养基上。

4.5 构建双杂交体系的穿梭质粒4.5.1 穿梭质粒（shuttle plasmid ）既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母菌中复制和表达的质粒。

4.5.2 双杂交体系需要两种穿梭质粒分别携带已知的靶蛋白基因和携带未知基因序列。

（1）BD-plasmid靶基因按正确的读码结构和取向克隆在GAL4的BD之后。

P: ADH1启动子。

T: ADH1终止子。

ADH：Alcoholdehydrogenase核定位信号是GAL4本身的一部分筛选标志：TRP（2）AD-plasmid外源基因按正确阅读框克隆到GAL4的AD片断之后。

P: ADHI启动子。

T: ADHI终止子。

核定位信号是SV40的T抗原的序列筛选标志：LEU24.6 酵母双杂交的实验过程报告基因：HIS（合成组氨酸）4.6.1 把蛋白A插入到BD质粒上（pGBT9）4.6.2把蛋白B插入到AD质粒上（pGAD424）4.6.3 两种重组质粒共同转化酵母菌（HF7c）4. 6.4筛选观察（1）存活选择在缺少亮氨酸（LEU）和色氨酸（TRP）培养基上筛选双载体转化子。

双载体转化才能合成亮氨酸和色氨酸，菌体存活。

Trp-Leu-（2）蛋白结合选择在缺少组氨酸（HIS）、亮氨酸（LEU）和色氨酸（TRP）的培养基上筛选蛋白A和蛋白B 能相互作用的双载体转化子。

His-Trp-Leu-。