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1）酶传感器的原理
酶传感器主要由固定 化酶膜和变换器组成： 固定化酶膜：选择性 地“识别”并催化被 检测物质发生化学反 应 变换器：把催化反应 中底物或产物的变量 转换成电信号，通过 仪表显示出来。
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（2）酶电极（葡萄糖氧化酶电极） 半透膜 酶胶层
感应电极
1967年Updike等采用 酶的固定化技术，将葡萄 糖氧化酶固定在疏水膜上， 然后再和氧电极结合，组 装成了世界上第一个生物 传感器——葡萄糖氧化酶 电极。
酶分子中可以形成共价键的基团：
氨基、羧基、巯基、羟基、酚基、咪唑基
载体 活泼基团
载体活化的方法
1. 活化
酶辅助蛋白交联法
酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联
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固定化方法与载体的选择
1.必须注意维持酶的催化活性和专一性 2.酶与载体结合牢固 3.载体的机械强度 4.固定化酶要有最小的空间位阻 5.载体稳定，不可与底物、产物发生反应 6.固定化酶要廉价
3
4
5 6
7
游离酶：
固定化酶：
四、固定化酶的应用
Go 1.在工、农业生产上的应用 Go 2.在医药、治疗上的应用 Go 3.在分析化学中的应用
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1、固定化酶在工农业生产上的应用
产物
酶或细胞
L-氨基酸 果糖浆
氨基酰化酶 葡萄糖异构酶或含该酶菌体
6-APA L-门冬氨酸 L-苹果酸 低乳糖牛奶
原料
乙酰-DL-氨基酸 葡萄糖 青霉素G 反丁烯二酸 反丁烯二酸 牛奶 牛奶 蛋白 桔类果汁 生啤酒 植物油 植物油
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产物
类固醇 L-丙氨酸
D-苯甘氨酸 ATP 核苷酸类味 精 乙醇
啤酒
L-亮氨酸 乙酸 乳酸 淀粉酶 杆菌肽 氢气
酶或细胞
固定化方法
原料
含脱氢酶及羟化酶的菌体 含有L-门冬氨酸、β-脱羧酶的菌 体 氨基酰化酶 乙酰激酶 5’-磷酸二酯酶，5’-腺苷酸脱氨酶 Sacharomyces carlsbergensie 或S.Cerevisiae 同上
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三 固定化酶的性质
1、分配效应
由于载体和底物的性 质差异引起了微环境和宏 观环境之间的性质不同。 微环境是在固定化酶附近 的局部环境，而将主体溶 液称为宏观环境。由这种 不同造成的底物、产物和 各种效应物在两个环境之 间的不同分配，被称为分 配效应。
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2、空间障碍效应
固定化之后，由于酶的空间自由度受到限制(因为载体 的空隙太小，或者固定化方式与位置不当，给酶的活性部 位造成了空间屏障)，使酶分子的活性基团不易于底物或效 应物接触，影响酶分子的分子活性中心对底物的定位作用, 所造成的对固定化酶的活力的影响效应，被称为空间障碍 效应。
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（2）通过“体外循环”做成人工脏器
固定化酶也可做成“人工脏器”参与体外循环， 应用有两方面：
用于除去有害的毒性物质及有潜在毒害作用的代谢产物 除去氨基酸，使需要这些物质的病变组织“饿死”；治疗时
只需将患者的血液引出体外，通过由固定化酶等构成的“人 工脏器”加以处理，然后再回流体内。
61
实例：
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2） 内扩散阻力是指底物分子达到固相酶表面后 传递到酶活性部位时的一种扩散阻力，它与催化 反应同时进行。
载体小而弯曲的细孔是产生内扩散阻力的主 要原因。因此使用低分子量底物，小的粒径、载 体孔尽可能大而直且互相连通，或仅仅将酶固定 在载体表面都可以降低这种内扩散阻力。
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对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解。
1953年 1969年 1971年 1973年
Grubhofer,Schleith 以聚氨基苯乙烯固定羧肽酶、 淀粉酶、胃蛋白酶
千火田一郎
固定化氨基酰化酶，DL-氨基 酸拆分
第一届国际酶工程 固定化酶：Immobilized
大会
Enzyme
日本
固定大肠杆菌生产天冬氨酸
1979年 1982年 日本
固定化植物细胞：长春花和毛 地黄细胞
青霉素酰胺酶 含有门冬氨酸的菌体 含有反丁烯二酸酶的菌体 乳糖酶
乳糖
碱性蛋白酶
干蛋白
葡萄糖氧化酶和氧化氢酶
果汁脱苦 啤酒
柚苷酶 木瓜蛋白酶
植物白脱 脂肪酶
脂肪酸
脂肪酶
固定化方法
载体结合法 载体结合法或交联法 载体结合法 胶格包埋法 胶格包埋法 载体结合法 载体结合法 胶格包埋法 载体结合法 载体结合法或包埋法 胶格包埋法 载体结合法
(2) 能用电脑自动检测和调控，从而获得最佳的反应条件。
(3) 应具有良好的传质和混合性能。传质是指底物和产物在反 应介质中的传递。传质阻力是反应器速度限制的主要因素。
(4) 应具有最佳的无菌条件，否则，杂菌污染使反应器的生产
能力下降。
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3.常见的酶反应器
按结构区分 搅拌罐式反应器（Stirred Tank Reactor, STR） 鼓泡式反应器(bubble column reactor, BCR ) 填充床式反应器(packed column reactor, PCR ) 流化床式反应器( Fluidized Bed Reactor, FBR) 膜反应器(Membrane Reactor, MR)
固定原生质体生产谷氨酸
二、固定化酶的制备
（一）、酶的固定化方法
吸附法
包埋法 结合法
胶体包埋法 半透膜包埋法 离子键结合法 共价键结合法
交联法
热处理法
1.吸附法
吸附法是利用各种固体吸附剂将酶或含酶 菌体吸附在其表面上而使酶固定化的方法。
活性炭、氧化铝、硅藻 土、多孔陶瓷、多孔玻 璃、硅胶、羟基磷灰石。
酶电极示意图
葡萄糖氧化酶
葡萄糖＋醌＋H2O
葡萄糖酸＋氢醌
氢醌
Pt 醌＋2H＋＋2e－
铂电极
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（3）脲电极 Urea + 2H2O
脲酶
2NH4++2HCO3-
产生的2NH4+为阳离子电极感应。
此外还有： 氨基酸电极 醇电极 尿酸电极 乳酸电极 青霉素电极 亚硝酸离子电极：菠菜亚硝酸还原酶产生NH3
晶体 L-Ala
消 旋 反 应 器
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2、固定化酶在医药治疗上的应用
溶液酶的应用缺陷： 酶作为异体物质，在体内应用会导致免疫反应 酶是蛋白质，在体内易被网状内皮系统移除和
被蛋白质酶水解破坏 由于稀释效应，药物酶无法集中于靶器官组织
以达到治疗所需的最适高浓度
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（1）转入体内发挥作用（口服和注入）
（1）离子结合法：通过离子键使酶与载体结 合的固定化方法。
+ -+
+-+ -
-
-
++++++-++ -
--
-
-+-+++++++
载体：DEAE纤维素、 TEAE纤维素、 DEAE葡聚糖凝胶 ……
（2）共价结合法：通过共价键将酶与载体结 合的固定化方法。
载体：纤维素 琼脂糖凝胶 葡聚糖凝胶 甲壳质 氨基酸共聚物 ……
类固醇前体 L-门冬氨酸 乙酰-DL-苯基苷氨酸 ADP RNA 葡萄糖培养基
苏氨酸培养基 乙醇培养基
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实例：
A.葡萄糖异构酶
世界上生产规模最大， 应用最为成功的一种固定化 酶。
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A-L-Ala A-D-Ala
储 罐
固定化酶 柱子
泵
离心机
反应产物
L-Ala A-D-Ala
B. 氨基酰化酶（Aminoacylase） 世界上第一种工业化生产的固定化酶
优点：操作简单、条件温和、 载体廉价易得、可反复使用。
缺点：结合力不劳、容易脱落。
2.包埋法
将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中， 使酶固定化的方法称为包埋法。
载体：琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、 聚丙烯酰胺……
（1）凝胶包埋法：以各种多孔凝胶为载体，将酶、 细胞或原生质体包埋在凝胶的微孔内的固 定化方法。
Serratia marcBacillus substilis Bacill sp. Clostridium butyicum Rhodospirillium rubrum
胶格包埋法 包埋法
载体结合法 载体结合法 载体结合法
角叉胶或聚丙烯 酰胺胶包埋 聚乙烯氯或多孔砖 吸附或海藻酸包埋 角叉胶包埋 水合氧化钛吸附 明胶包埋 聚丙烯酰胺胶包埋 聚丙烯酰胺胶包埋 聚丙烯酰胺或琼脂包 埋
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3、固定化酶在分析化学中的应用
固定化酶在生化分析和临床检验中的应用也是一个十 分重要的领域，它的发展非常迅速，这不仅因为它们 比较稳定，可反复使用，能实行自动化、连续化等， 而且因为它们对抑制剂和活化剂比较不敏感，因此可 用于较复杂体系的检测。
分析化验中应用的固定化酶大体分为两类： 酶传感器(酶电极) 固定化酶柱检测器,包括固定化酶柱和检测器
按操作方式区分 分批式反应(batch ) 连续式反应(continuous ) 流加分批式反应(feeding batch )
混合形式 连续搅拌罐反应器（Continuous Stirred Tank Reactor, CSTR）
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血乳酸分析仪
SBA-70型血糖乳酸自动分析仪
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HI96707 亚硝酸离子浓度比色仪
青霉素过敏皮试测试仪
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四、固定化酶反应器
Go 1、什么是酶反应器? Go 2、理想酶反应器的要求 Go 3、各种酶反应器的特点 Go 4、酶反应器的选择和使用 Go 5、酶反应器的设计 Go 6、酶反应器的发展
第五章 酶固定化