实验2 特殊显微镜及其使用
暗视野显微镜 相差显微镜
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一、实验目的
1.学习暗视野显微镜的原理、了解其构造 2.练习暗视野显微镜的使用
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二 暗视野显微镜的原理及构造
根据丁达尔效应原理设计的一种在黑色背景条 件下观察被检物体的显微镜
观察到明场看不到的极其微小的物体 最高分辨率可达0.004微米
(3)视场光圈如不在视野中央，可利用聚光 镜外侧两个调节螺丝进行调整，再将其 开大到相应位置。
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自己动手制作暗视野显微镜
暗视野光挡 (左：金属片或厚卡纸制成; 右：透明滤色镜贴黑纸制成)
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三、实验用品
1.材料：口腔黏膜上皮细胞、洋葱内表皮细胞 2.试剂：生理盐水、蒸馏水 3.器材和仪器：载玻片、盖玻片、显微镜、擦
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暗视野显微镜原理
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2.3 成像特点及优缺点
在暗视野中所观察到的是被检物体的衍射 光图像，并非物体本身，所以只能看到物体的 存在和运动，不能辨清物体的细微结构。但被 检物体为非均质时，并大于1／2波长，则各级 衍射光线同时进入物镜，在某种程度上可观察 物体的构造。
一般暗视野显微镜虽看不清物体的细微结 构，但却可分辨0.004um以上的微粒的存在和 运动，这是普通显微镜(最大的分辨力为0.2um) 所不具有的特性，可用以观察活细胞的结构和 细胞内微粒的运动等。
调轴望远镜是用来进行合铀调节的。相差显微 镜在使用时，聚光镜下面环状光阑的中心与物 镜光轴要完全在一直线上，必需调节光阑的亮 环和相板的环状圈重合（共轭重合），才能发 挥相差显微镜的效能。否则直射光或衍射光的 光路紊乱，应被吸收的光不能吸收，该推迟相 位的光波不能推迟，就失去了相差显微镜的作 用。
使普通聚光器部分进入光路。先使用低倍相差物镜，
按普通显微镜操作方法进行对光和调焦。 旋转环状
光阑，使光阑的直径和孔宽与所使用的相差物镜相
适应，如相差物镜为40X时应用40X标示孔的光阑。
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（3）合铀调整
拔出目镜，插入合铀望远镜，一边从望远 镜向内观察，并用左手固定其外筒；一边用右 手转动望远镜内筒使其上升，当对准焦点就能 看到环状光阑的亮环和相板的暗环，此时可将 望远镜固定住。再升降集光器并调节其下的螺 旋使亮环的大小与暗环一致，然后左右前后调 节环状光阑聚光器上的调节钮，使两环完全重 合。
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使用方法
（1）相差装置的调换安装
卸下普通显微镜使用的聚光器，将环状光阑装 在聚光器支架上，把绿色滤光片放在上面，它可吸 收红色和蓝色光，使波长范围小的单色光线进行照 明，并有吸热作用，能使相差观察获得良好的效果。 再从转换器上旋下普通物镜，换上相差物镜。
（2）调焦
打开光源，旋转集光器转盘，将“0”对准标示孔，
可编辑版Βιβλιοθήκη 32.1 原理丁达尔现象：在日常生活中，室内飞扬的微粒 灰尘是不易被看见的，但在暗的房间中若有一束 光线从门缝斜射进来，灰尘便粒粒可见了，这就 是微粒发光。
暗视野显微镜就是利用微粒发光原理设计的。
2.2 结构特点
使用中央遮光板或暗视野聚光器（常用的是抛 物面聚光器），使光源的中央光束被阻挡。不能 由下而上地通过标本进入物镜。从而使光线改变 途径，倾斜地照射在观察的标本上，标本遇光发 生反射或散射，散射的光线投入物镜内，因而整 个视野是黑暗的。
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一、实验目的
1.学习相差显微镜的原理、了解其构造
2.练习相差显微镜的使用
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二 实验原理
光波有振幅（亮度）、波长（颜色）及相位(指 在某一时间上光的波动所能达到的位置)的不同。
当光通过物体时，如波长和振幅发生变化，人们 的眼睛才能观察到，这就是普通显微镜下能够观察 到染色标本的道理。而活细胞和未经染色的生物标 本，因细胞各部微细结构的折射率和厚度略有不同， 光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位有 变化(相应发生的差异即相位差)，而这种微小的变 化，人眼是无法加以鉴别的，故在普通显微镜下难 以观察到。
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相差显微镜能够改变直射光或衍射光的相位， 并且利用光的衍射和干涉现象，把相位差变成 振幅差(明暗差)，同时它还吸收部分直射光线， 以增大其明暗的反差。因此可用以观察活细胞
或未染色标本。
结构特点
相差显微镜与普通显微镜的主要不同之处是： 用环状光阑代替可变光阑，用带相位板的物镜 代替普通物镜，并带有一个合轴调节用的望远 镜。
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2.4 应用：微小粒子、细菌形态、细菌记数，透 明标本观察等。
2.5 暗场显微镜的要求 • 要求载玻片和盖玻片必须无疵痕和灰尘 • 物镜前透镜必须清洁无尘 • 载玻片和盖玻片厚度必须绝对符合要求
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1.6 暗场观察方式调节
(1)换上暗场聚光镜。
(2)将视场光阑适当缩小，用10X物镜找到 被检物体，同时在视场中看到视场光圈 的轮廓象。上下缓慢调整聚光镜，使视 场光圈像清晰可见。
镜纸等
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四、实验内容
1、口腔黏膜上皮细胞和洋葱内表皮细胞装片 制作
2、用暗视野显微镜观察样品
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五、作 业
绘制暗视野内的口腔黏膜上皮细胞和洋葱内 表皮细胞图（3-5个细胞）。
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（二）相差显微镜
相差显微镜（phasecontrast microscope）由荷 兰物理学家泽尔尼克(Frits Zernike ,1898-1966),于 1932年发明，并因此获1953年诺贝尔物理奖。
环状光阑是由大小不同的环状孔形成的光阑， 它们的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的。
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相差显微镜的特殊构造与光路
相差显微镜的可特编辑殊版构造与光路
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相差显微可镜编辑的版 光路
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相位板安装在物镜的后焦面处，相板装有吸收 光线的吸收膜和推迟相位的相位膜。它除能推 迟直射光线或衍射光的相位以外，还有吸收光 使亮度发生变化的作用。
（4）观察
换回目镜，按常规要领进行观察。在更换 不同倍率的相差物镜时，每一次都要使用相匹 配的环状光阑。
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用途
用于观察组织培养中活细胞形态结构。 活细胞无色透明，一般光镜下不易分辨 细胞轮廓及其结构，组织培养研究常用 的是倒置相差显微镜。