1. 从生产中选育 2. 定向培育优良品种 一般指用特定因素长期处理微生物群体，同时不断地 对它们进行移种传代，以达到积累并选择相应的自发突变 株的目的。 例：卡介苗（牛型结核分枝杆菌的减毒活菌苗）
第六节 原核生物的基因重组
基因重组（gene recombination）： 将两个不同性状个体的基因通过一定的方式转移到一 起，并发生重新组合，产生新的遗传性状的过程，称 为基因重组(gene recombination)或遗传重组。 重组：遗传物质在分子水平上发生的交换； 杂交：在细胞水平上遗传物质的交换. 杂交必然包含着重组，但重组不仅限于杂交这一形式。
2.诱变及化学致癌物质的检测——Ames实验 3.DNA损伤的修复
第五节 微生物的诱变育种
一、诱变育种中的几个原则
指利用物理或化学诱变剂处理微生物群体细胞，促进其突变 率显著提高，然后设法从中选取少数符合育种目的的突变株。
2个主要环节： 诱变（随机） 选用合适的诱变剂和诱变剂量处理大量均匀 、分散的微生物细胞，以引起绝大多数细胞 致死的同时，使存活个体中的突变频率大大 提高。
（五）突变株的筛选
1. 初筛（以量为主） 方法需简便、快速
2步
初筛 复筛
（1）利用形态变异：需预先测定形态与产量的相关性 （2）根据平板颜色反应直接挑选 透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）； 抑菌圈法（抗生素）； 变色圈法（柠檬酸）、显色圈（氨基酸）； 沉淀圈法（外毒素） 透明圈直径（H）/菌落直径（C）：产量高低（初筛指标） 2. 复筛（以质为主，定量测定） 摇瓶培养，直接检测所需产物
感受态细胞（competent cell） ：具有摄取外源
受细菌自身的基因控制 DNA能力的细胞
（如肺炎链球菌的感受态出现在对数生长期）
人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有
自然遗传转化（natural genetic transformation）
人工转化（ artificial transformation ） 摄取DNA 的能力，或人为地将 DNA导入细胞内。
化合物代号 1 2 3 4 5 5 6 7 8 9 6 10 10 11 12 13 7 11 14 14 15 16 8 12 15 17 17 18 9 13 16 18
5
（3）营养缺陷型的用途 • 生产菌 (氨基酸、核苷酸、维生素等高产菌需求)； • 研究代谢途径和杂交、转化等遗传规律的遗传标记。
加抗生素(或菌丝过滤)，培养过夜
③ 营养缺陷型的检出
夹层培养法 限量补充培养法 逐个检出法 影印平板法
方法
④ 营养缺陷型的鉴定
生长谱法： 分两步：
快速，直观
a.三大类营养要求（氨基酸、维生素、核苷酸）的鉴定 b.具体到某一种营养要求的鉴定(哪一种氨基酸,哪一种 维生素,或哪一种碱基)
具体操作:一般采用“滤纸片法”
筛选（定向）
设计有效的筛选方法，将少量正变株中的 优良菌株挑选出来。
（一） 出发菌株（original strain）
出发菌株指用于诱变育种的起始菌株。 出发菌株的选择标准： • 具有有利性状（如高产、生长速度快、营养要求粗放、 标记明显等）； • 对诱变剂敏感 出发菌株的来源： •野生型菌株； •从生产中选育的自发突变菌株； •诱变获得的高产菌株
• (2) 转化过程
ds DNA 供体(strR) 感受态受体(strS) 酶解与吸收单链
转化因 子进入 细胞 转化因 子单链 配对与 整合
同源区段配对
单链整合
复制与分离
复制
分离
பைடு நூலகம்非转化子(strS)
感受态因子： 调节感受态的一类特异蛋白，它包括三种主要 （该过程与细菌自身的遗传控制无关！）
成分：膜相关DNA结合蛋白、细胞壁自溶素和几种核酸酶。
进行自然转化，需要二方面必要的条件：
（1）建立了感受态的受体细胞 （2）外源游离DNA分子
感受态的机理研究： 局部原生质体化假说：
处于感受态的细胞局部失去了细胞壁，使外源DNA能顺利经膜 进入菌体。
三大类营养要求的鉴定： a. 不含维生素的酪素水解液或氨基酸混合液或蛋白胨 b. 水溶性维生素混合液 c. 0.1%碱水解酵母核酸液
a
b
c
单一营养物质要求的鉴定：
组 以氨基酸缺陷为例进行说明 别 将18种氨基酸按右表分为6组 1 2 特点：每2组只有一种共同物质 3 1 4 5 6 2 6
3 4
（二） 菌悬液的制备
1. 选用单细胞或单孢子悬液（均匀、分散） 目的：①使每个细胞能均匀接触诱变剂； ②减少表型延迟现象（诱变后性状的分离及退化现象） 2. 同步培养（生理状态一致） 3. 菌龄：对诱变剂最敏感时期 4.菌悬液的制备方法 营养细胞：对数期 孢子或芽孢：萌发前期
物理诱变：生理盐水配制 化学诱变：缓冲液配制 酵母菌，霉菌的孢子：106个/mL 细菌，放线菌孢子：108个/mL
如：异烟肼（“雷米封”）是吡哆醇的结构类似物 ，利用含异烟肼梯度平板筛选异烟肼抗性突变株， 可达到定向培育吡哆醇高产突变株的目的。 加入不含异烟肼的底层 敏感
菌苔
为什么在筛选突变株时 ,不能直接用代谢产物, 抗性 菌落 而必须用其结构类似物 ? 加入含异烟肼的上层
2. 营养缺陷型突变株的筛选
（1）几个概念： 三类培养基： 基本培养基（MM, minimal medium）[-]： 某野生型能生长的最低成分的组合培养基。 完全培养基（CM,complete medium）[+]： 各种营养缺陷型能生长的天然或半组合培养基 补充培养基（SM, supplemental medium）[A]:[-]+A [B]:[-]+B 相应营养缺陷型能生长的组合或半组合培养基
酶受体假说：
受体细胞表面出现了一种能结合DNA并使之进入细胞的酶。
2. 转化模型
（1）转化因子 本质是离体的 DNA片断或质粒 DNA 。转化因子进入细胞前 还会被酶解成更小的片段，约8kb。在不同的微生物中，转化因 子的形式不同，dsDNA,ssDNA. 革兰氏阴性的嗜血杆菌中，细胞只吸收dsDNA形式的转化因 子，但进入细胞后需经酶解为ssDNA，才能与受体菌的基因组整 合； 革兰氏阳性的链球菌和芽孢杆菌中，dsDNA的一条链必须在 胞外降解，只有ssDNA形式的转化因子才能进入细胞。 但不管何种情况，最易与细胞表面结合的仍是dsDNA。 由于每个细胞表面能与转化因子相结合的位点有限（如肺 炎链球菌约10个），因此，从外界加入无关的dsDNA就可竞争并 干扰转化作用。 质粒 DNA也是良好的转化因子，但它们通常并不能与核染 色体组发生重组。 转化的频率通常为0.1％～1％，最高为20％。
在产量变异工作中，常采用相对杀菌率为70~75%, 甚至 30~70%的剂量。
UV的剂量: 固定UV功率和照射距离,以照射时间长短来 确定剂量多少。
3. 诱变处理方法
单因素处理或多因素的复合处理： ①同一诱变剂的重复使用； ②两种或多种诱变剂的先后使用； ③两种或多种诱变剂的同时使用.
（四） 中间培养（CM，培养过夜）
诱变育种的程序：实验讲义p174
出发菌株（纯化） 前培养（ CM ，培养至对数期） 菌悬液制备 活菌计数
诱变预备实验（剂量存活率曲线） 诱变处理（相对杀菌率为70-75%，30-70%） 活菌计数 中间培养（CM，培养过夜，克服表型延迟） 突变株分离 初筛 复筛 生产性能试验 菌种（鉴定与）保藏
三、自发突变与育种
目前已知有二十多个种的G+和G-细菌具有自然转化的能力 此过程可以发生在土壤和海洋环境中，可能是自然界遗传交 换的重要方式。
1. 感受态 自然感受态与人工感受态的不同？
自然感受态
感受态：是指受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化 的一种生理状态。一个细菌能否出现感受态是由其遗传性决 的出现是细胞一定生长阶段的生理特性 定的，但受环境条件的影响也很大，因而表现差别很大。
（2）筛选步骤（5步）
诱变处理 中间培养 淘汰野生型 检出缺陷型
鉴定缺陷型
①中间培养
CM或SM培养基，培养过夜。克服表型延迟。
②淘汰野生型 方法
即浓缩缺陷型，以提高检出率
抗生素法（G+细菌：青霉素；酵母菌和霉菌：制霉菌素） 菌丝过滤法（丝状真菌、放线菌） 饥饿培养（无N）MM 6~12 h 2N培养(2N)MM 1~2 h
目的：克服表型延迟 表型延迟（phenotypic lag）：表型的改变落后于基因型改变的 现象. 分离性延迟： 突变的基因经 DNA复制和细胞分裂后变成纯 分离性延迟的原因 : 对数生长期中，单核细胞常出现双核 现象，多核细胞的核也成倍增加，诱变对数期的细胞时，突 合状态，表型才能表现出来。 变通常发生在一个核上，故其变异或非变异的细胞必须经过 生理性延迟: 由杂合状态变为纯合状态，突变表型仍不能 生理性延迟的原因 生理性延迟： : 当变异细胞由杂合状态变为纯合状态 一代或几代繁殖才能分离，这种纯种变异细胞出现的推迟现 时,由于杂合期所合成的非变异的蛋白或酶仍然发挥作用 ,必 表现出来。 象称为分离延迟现象。 须经过细胞多代分离后,才能将这些非变异的酶稀释掉,最终 达到变异后应该表现的形态,如营养缺陷型突变株的筛选过 程。
第一节 遗传变异的物质基础 第二节 质粒 第三节 基因突变的规律及类型
1. 突变的定义 2.基因突变的特点(规律) 自发性\不对应性\独立性\稀有性\可诱变性\稳定性\可逆性 3.证明基因突变自发性和不对应性的实验证据 4.基因突变的类型
第四节 基因突变的机制
1.基因突变的分子基础
自发突变 诱发突变(化学诱变/物理诱变/生物诱变)
5. 菌悬液的浓度
（三）诱变剂的选择及处理方法
1. 诱变剂的选择（高效，简便） 物理诱变剂：频度低，大损伤，难修复，且操作简便； 化学诱变剂：频度高，点突变，易回复突变，操作麻烦。 ( NTG——超诱变剂）