拉曼光谱1.1引言拉曼光谱和红外光谱都反映了分子振动的信息，但其原理却有很大差别：红外光谱是吸收光谱，而拉曼光谱是散射光谱。

红外光谱的信息是从分子对入射电磁波的吸收得到的，而拉曼光谱的信息是从入射光与散射光频率的差别得到的。

拉曼光谱的突出优点是可以很容易地测量含水的样品， 而且拉曼散射光可以在紫外和可见光波段量测。

由于紫外光和可见光能量很强，因此其量测比红外波段要容易和优越得多。

拉曼光谱得名于印度物理学家拉曼(R a m a n)。

1928年， 拉曼首先从实验观察到单色的入射光投射到物质中后产生的散射，通过对散射光进行谱分析，首先发现散射光除了含有与入射光相同频率的光外，还包含有与入射光频率不同的光。

以后人们将这种散射光与入射光频率不同的现象称为拉曼散射。

拉曼因此获得诺贝尔奖。

当一束入射光通过样品时，在各个方向上都发生散射。

拉曼光谱仪收集和检测与入射光成直角的散射光。

由于收集和检测的散射光强度非常低，因此拉曼光谱的应用和发展受到很大限制。

六十年代激光开始广泛应用，拉曼光谱仪以激光作光源， 光的单色性和强度都大大提高，拉曼散射仪的信号强度因而大大提高，拉曼光谱技术得以迅速发展，应用领域遍及物理，材料，化学，生物等学科，并已成为光谱学的一个分支 拉曼光谱学。

2.1拉曼光谱原理2.1.1光的散射入射光通过样品后，除了被吸收的光之外，大部分沿入射方向穿过样品， 一小部分光则改变方向，发生散射。

一部分散射光的波长与入射光波长相同， 这种散射称为瑞利散射(R a y l e i g h s c a t t e r i n g)。

1899年，瑞利从实验中得出结论：晴天时天空呈兰色的原因是大气分子对阳光的散射。

瑞利还证实：散射光的强度与波长的四次方成反比。

这就是瑞利散射定律。

由于组成白光的各种颜色的光中，兰光的波长最短，因而散射光强度最大。

天空因而呈现兰色。

瑞利当时并没有考虑到散射光的频率变化。

他认为散射光与入射光的频率是相同的。

所以后来把与入射光波长相同的散射称为瑞利散射，而把波长与入射光不同的散射称为拉曼散射。

2.1.2拉曼散射的产生2.1.2.1机械力学的解释光由光子组成，这是光的微粒性。

光子与样品分子间的相互作用， 可以用光子与样品分子之间的碰撞来解释。

光照射样品时，光子和样品分子之间发生碰撞。

如果碰撞时只是运动方向改变而未发生能量交换即发生了弹性碰撞，则光子的能量不变。

由E=hν，能量不变频率也就不变。

这就是瑞利散射产生的原因。

如果光子和样品分子间发生非弹性碰撞， 即光子除改变运动方向外还有能量的改变，一部分能量碰撞时在光子和样品之间发生交换，光子的能量有所增减，则光的频率发生改变。

2.1.2.2从能级之间的跃迁来分析光子和样品分子之间的作用也可以从能级之间的跃迁来分析。

样品分子处于电子能级和振动能级的基态，入射光子的能量远大于振动能级跃迁所需要的能量，但又不足以将分子激发到电子能级激发态。

这样，样品分子吸收光子后到达一种准激发状态，又称为虚能态。

样品分子在准激发态时是不稳定的，它将回到电子能级的基态。

若分子回到电子能级基态中的振动能级基态，则光子的能量未发生改变，发生瑞利散射。

如果样品分子回到电子能级基态中的较高振动能级即某些振动激发态，则散射的光子能量小于入射光子的能量，其波长大于入射光。

这时散射光谱的瑞利散射谱线较低频率侧将出现一根拉曼散射光的谱线，称为S t o k e s线。

如果样品分子在与入射光子作用前的瞬间不是处于电子能级基态的最低振动能级，而是处于电子能级基态中的某个振动能级激发态，则入射光光子作用使之跃迁到准激发态后，该分子退激回到电子能级基态的振动能级基态，这样散射光能量大于入射光子能量，其谱线位于瑞利谱线的高频侧，称为a n t i-S t o k e s线。

S t o k e s线和a n t i-S t o k e s线位于瑞利谱线两侧，间距相等，如图9.1所示。

S t o k e s线和a n t i-S t o k e s线统称为拉曼谱线。

由于振动能级间距还是比较大的，因此，根据波尔兹曼定律，在室温下，分子绝大多数处于振动能级基态，所以S t o k e s线的强度远远强于a n t i-S t o k e s线。

拉曼光谱仪一般记录的都只是S t o k e s线。

2.1.3拉曼散射的选择定则外加交变电磁场作用于分子内的原子核和核外电子，可以使分子电荷分布的形状发生畸变，产生诱导偶极矩。

极化率是分子在外加交变电磁场作用下产生诱导偶极矩大小的一种度量。

极化率高，表明分子电荷分布容易发生变化。

µ=αE如果分子的振动过程中分子极化率也发生变化，则分子能对电磁波产生拉曼散射，称分子有拉曼活性。

有红外活性的分子振动过程中有偶极矩的变化，而有拉曼活性的分子振动时伴随着分子极化率的改变。

因此，具有固有偶极矩的极化基团，一般有明显的红外活性，而非极化基团没有明显的红外活性。

拉曼光谱恰恰与红外光谱具有互补性。

凡是具有对称中心的分子或基团，如果有红外活性，则没有拉曼活性;反之，如果没有红外活性，则拉曼活性比较明显。

一般分子或基团多数是没有对称中心的，因而很多基团常常同时具有红外和拉曼活性。

当然，具体到某个基团的某个振动，红外活性和拉曼活性强弱可能有所不同。

有的基团如乙烯分子的扭曲振动，则既无红外活性又无拉曼活性。

由于散射效率大约为10-6~10-7，所以通常使用激光器作为光源，通过滤片和聚焦镜投射到样品上。

这时光向各个方向散射。

散射光包括瑞利散射(弹性散射)和拉曼散射(非弹性散射)。

弹性光散射强度比拉曼散射高出103以上，所以色散系统必须精心设计，消除种种杂散光。

为了达到高分辨率，一般采用双联或三联单色仪作为分光系统。

一般在与入射光成90度的方向上接收散射光，采用光电倍增管作为接收器，然后经过信号处理电子系统和计算机，从显示屏或记录仪输出。

输出参数为各个波数上的散射光绝对值，散射光波数的绝对值和拉曼波数(即入射光与散射光的波数差)，可以直接显示在屏幕上。

2.1.4谱峰(谱线)位置峰位是样品分子电子能级基态的振动态性质的一种反映。

它是用入射光与散射光的波数差来表示的。

峰位的移动与激发光的频率无关。

拉曼散射强度与产生谱线的特定物质的浓度有关，成正比例关系。

而在红外谱中，谱的强度与样品浓度成指数关系。

)样品分子量也与拉曼散射有关，样品分子量增加，拉曼散射强度一般也会增加。

对于一定的样品，强度I与入射光强度I0、散射光频率νs、分子极化率α有如下关系：I=C I0νs4α2这里C是一个常数。

在共振拉曼谱中，谱的加强是由于极化率α的增加引起的。

当入射光引起分子中电荷的平移时，则发生散射。

电荷的平移通过分子极化率反映出来。

散射的强度与极化率的平方成正比。

当激发光的频率接近且小于两个电子能级之间的频率差时，则产生所谓的p r e r e s o n a n c e，当激发光的频率等于两个电子能级之间的频率差时，则会发生共振，这时产生很大的电子电荷频移或分子变形的概率很高，这时就会产生对光的吸收。

这也说明对于某些振动，当入射光接近或等于某个吸收跃迁频率时，极化率会变得比较大。

这种振动称为共振加强的(r e s o n a n c e e n h a n c e d)振动。

这种加强取决于电子跃迁的强度及振动的对称性。

如果只有一个单一的电子态，则振动加强必须是对称的。

即这种振动不能改变分子的对称性。

如果某个被激发的生色团有不止一个电子跃迁，则振动的对称性就不那么重要了。

共振拉曼谱典型的增强倍数是102~103，因此共振拉曼谱在10-4m o l⋅d m-3或更低的样品浓度下即可测得。

这样，共振拉曼谱就提供了一种以接近紫外光谱的灵敏度选择性地探测生色团振动频率的手段。

共振拉曼在研究生物大分子的结构和功能时很有用，多生物分子都含有能给出共振拉曼谱的基团，如类胡萝卜素、黄素、视紫红质、各种含铜与铁的化合物、叶绿素等。

共振拉曼谱仪的使用范围主要受到激光光源频率有限这一现实情况的限制。

和红外谱相比，拉曼光谱有以下优点：(1)一些在红外光谱中为弱吸收或强度变化的谱带，在拉曼光谱中可能成为强谱带，例如基团S-S、C=C、N=N、C≡C、C≡N、C=S、S-H、X=Y=Z、C=N=C、O=C=O等。

环状化合物对称伸缩振动具有很强的拉曼谱线，用拉曼光谱来研究比较方便。

(2)拉曼光谱在低波数方向的测量范围较宽，常规测量范围为40~4000c m-1，有利于重原子的振动信息研究。

在低波数范围内，红外光谱的测量有困难。

但拉曼光谱所测定的是∆ν，因此可以选择适当的激发光(ν')来把振动光谱移到便于测定的紫外、可见光区域。

(3)拉曼光谱样品大小形状可以多样，不必粉碎、研磨，不必透明。

而且样品池或样品杯也可以采用玻璃材料，因为玻璃是弱拉曼散射体。

(4)拉曼光谱比较适于测试生物样品。

生物样品一般含水，而水对红外光有很强的吸收，因此用红外光谱测试生物样品技术上要求较高。

但拉曼光谱中水的吸收比较弱，因此是含水生物样品的理想检测手段。

许多情况下，可以用拉曼光谱来检测活体中的生物物质。

只要样品对激光能量吸收不强，测量时就不至造成样品结构上的变化。

现在，一些拉曼谱仪上还有专门的显微附件，可以检测样品上微小区域内的物质组分和结构。

(5)拉曼光谱中没有倍频和组合频等红外谱中常见的干扰，因此拉曼光谱比红外光谱简单，容易分析。

(6)拉曼光谱的激发光和拉曼散射光在紫外-可见波段能量较红外光高，因此检测起来比红外光谱容易。

但拉曼光谱也有一些缺点：(1)有些样品本身的发光本底较强，这样就使得拉曼光谱的信噪比受到影响。

此外，样品分子量增加时拉曼光谱的信噪比也会降低。

(2)激光束焦点上能量集中，可能对样品造成损伤。

付力叶拉曼光谱仪的出现，在一定程度上克服了上述缺点，为拉曼光谱更广泛的应用提供了更有力的手段。

2.2拉曼光谱的应用2.2.1生物大分子结构与功能的研究拉曼光谱与红外谱的应用范围类似。

对于生物学的应用来说，拉曼光谱仪的主要优点是水峰干扰较小，特别是在200~2000c m-1这个范围，拉曼光谱在水和重水中都可以测。

在这个范围内，有一些低频的振动对构象变化很敏感。

例如胱氨酸二硫桥上的S-S伸缩振动，在675c m-1处有一个很强的拉曼峰。

又如C-S振动在510c m-1左右有一个峰，其它一些芳香侧链和核酸上也有若干振动。

这些基团都是高度可极化的，往往能给出很强的拉曼谱线。

i.用拉曼光谱识别氨基酸：利用拉曼光谱可以分析蛋白质的氨基酸组成。

R.C.L o r d和N.T.Y u首先测定了不同氨基酸在不同p H值下的拉曼光谱，然后把这些不同氨基酸的拉曼光谱按照已知的溶菌酶的氨基酸组成进行迭加，并与溶菌酶的水溶液进行比较，发现两者有相当程度的一致性。