盐法提取菠萝蛋白酶的研究
张桂香王元秀矫强石玉宝
济南大学化学化工学院生物技术系济南,250022
摘要：论文采用正交实验，运用盐析法从菠萝皮中提取菠萝蛋白酶，对菠萝蛋白酶的提取工艺及其影响因素进行了研究，并对提取后得到的菠萝蛋白酶进行测定。
关键词：菠萝皮、菠萝蛋白酶、正交实验、盐析法
前言：酶的应用已有几千年的历史。
特别是近30来，随着酶生产的不断发展，酶已广泛地用于食品、轻工、医药、环保以及科技等领域。
目前已经发现的酶约有3000种，但现在已应用的酶不足十分之一，而已工业化生产和应用的酶不过几十种[1]。
菠萝蛋白酶就是其中的一种酶，它存在于菠萝家族之中，它不仅存在于芽中，
而且也存在于果实之中。
通过压榨芽殖细胞，用丙酮、NaCl 或(NH
4)
2
So
4
使沉淀物
凝固的办法可获取菠萝蛋白酶[2]。
一般提取用的酶源是凤梨，但是价格较贵，约6000元/吨。
而用菠萝皮，不但可以减少资源的浪费，降低费用，又能减少环境的污染。
对于菠萝蛋白酶来说，使用盐析法提取是比较理想的一种方法，也使用的最广泛，其基本原理是：不同的蛋白质在高浓度的盐溶液中溶解度不同而能分离。
此法简便、安全[3]。
1、材料与设备
1.1 材料与试剂
菠萝皮：市场采集；高岭土、酪蛋白：化学纯
pH试纸：山师化工厂；其它试剂均为分析纯
1.2 仪器与设备
电子恒温水浴锅：DZKW-C型，黄骅市卸甲综合电器厂
数显温控仪（电热恒温培养箱）：ZJYY-XMT-142，上海跃进医疗器械厂
离心机：LG10-2.4A型，北京医用离心机厂
高速组织捣碎机：Ds-1，上海标本模型厂制造
架盘药物天平：Hc-TP11-1型，上海第二天平仪器厂
722光栅分光光度计:上海第三分析仪器厂
2、实验方法
2.1 菠萝蛋白酶的提取方法
2.1.1 工艺流程[4-5]
菠萝皮洗净→去杂→捣碎过滤→[滤液
滤渣→乙醇→浸提液→过滤→滤液
]→加苯甲酸钠→压出液→
10℃加白陶土→吸附物→加(NH
4)SO
4
调pH6.5-7→洗脱液→正交实验方法→粗制
品→溶解→NaOH调pH→待测液。
2.1.2流程说明
2.1.2.1滤液制备：选取干净的菠萝皮，除杂，在清水中漂洗三次，沥干，放入冰箱冷冻备用。
用高速组织捣碎机打浆，过滤，取滤液，滤渣加入乙醇进行第二次浸提、过滤，合并两次滤液，按汁加0.05%苯甲酸钠作防腐剂，送入冰箱存放备用。
2.1.2.2吸附、洗脱：压出汁液置不锈钢保温缸中，不断搅拌，加入汁液量的 4%白陶土，在10℃吸附15-20分钟，静置过夜，次晨虹吸除去上清液，留下湿陶土，
加入Na
2CO
3
饱和液调节pH6.5-7，再加入按湿土计50%的(NH
4
)
4
So
4
，搅拌25-30分
钟，进行洗脱。
2.1.2.3待测酶液制备:将上述洗脱液分别离心两次，取沉淀，溶解.按正交试验要求，加入食盐沉淀（盐析），5分钟后，离心，弃上清液，洗涤沉淀，过滤，定容。
2.2菠萝蛋白酶测定方法: C.D.U.方法[5]
2.3 菠萝蛋白酶盐析实验方法:利用L
25
(56)正交设计表[6]
表1 正交试验设计表
2 18 5 10
3 22 6 15
4 26 7 20
5 30 8 25
3、结果与讨论
3.1标准曲线测定结果
根据标准曲线测定方法，测定三次，取平均值,计算一元线性回归方程为A=0.0091x+0.03736,其中，A:吸光度，x：未消化酪蛋白的量。
3.2正交实验结果
从菠萝皮中按正交实验提取蛋白酶，并采用测定 C.D.U方法分别进行测定，结果如表2。
由表2可以看出，影响酶提取的影响因素主次顺序为B>A>C，最优组合为
A
1B
4
C
1
,即：NaCl的量14%，溶液的pH值7，沉淀温度为0℃为最佳。
表2 正交实验结果
实验号因素酶含量
A B C
1 1 1 1 16.093
2 1 2 2 23.479
3 1 3 3 27.349
4 1 4 4 28.134
5 1 5 5 24.521
8 2 3 4 20.600
9 2 4 5 23.845
10 2 5 1 24.754
11 3 1 3 14.989
12 3 2 4 21.829
13 3 3 5 15.254
14 3 4 1 25.505
15 3 5 2 24.325
16 4 1 4 18.838
17 4 2 5 21.281
18 4 3 1 19.884
19 4 4 2 24.017
20 4 5 3 26.390
21 5 1 5 23.414
22 5 2 1 21.198
23 5 3 2 25.130
24 5 4 3 22.662
25 5 5 4 24.075
K1
K2 和 K3
K4
K5 极差 R 120.576
103.027
101.902
110.410
116.479
18.674
89.708
105.141
108.317
124.263
124.095
34.555
107.434
113.425
104.744
113.476
108.315
8.732
4、结论
4.1用菠萝皮提取菠萝蛋白酶，工艺简单，提取率较高，可以解决资源的二次污染和浪费问题。
4.2食盐作为沉淀剂，可以使菠萝蛋白酶沉淀，用于酶提取，其添加量和浓度对酶提取有较大的影响。
4.3溶液酸碱直接影响菠萝蛋白酶的活性和提取量。
4.4用盐法提取菠萝蛋白酶的最佳条件为:NaCl量为14%,pH 值为7,且温度为0℃。
参考文献
1、郭勇著，《酶工程》，中国轻工业出版社,1984.
2、颜思旭、蔡红玉编《酶催化动力学原理与方法》，厦门大学出版社,1982.
3、罗就浦编《酶和酶工程》，上海交通大学出版社,1984.
4、陈来同、唐运编写《41种生物化学产品生产技术》，金盾出版社1994.
5、[德]施特尔马赫著、钱嘉渊译《酶的测定方法》，中国轻工业出版社,1979.
6、吴栩、李永乐、胡庆军、《应用数理统计》，国防科技大学出版社,1997.
英文题目：
Study on Bromelin Extracted by Salt Method
作者简介：张桂香，1975年生，女，硕士，讲师，主要从事于食品生物技术的研究
说明：论文在作者名单上稍做修改，敬请留意，对贵刊工作造成的不便敬请原谅。