• 冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1分钟后 即可染色。 如果不做染色，可用固定液固定放于恒冷箱。
冰冻切片的优点
• 1．简便，可以不需要对组织固定、脱水、透明、包埋等手续即可进 行切片，减少了一些中间环节。 • 2．快速，用时短。 • 3．组织变化不大。 • 4．能很好保存脂肪，类脂等成分。 • 5．能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类，特别是对于那些对有 机溶剂或热的温度耐受能力较差的细胞膜表面抗原和水解酶保存较好。
切片机
• 切片机的基本类型有五种，按其结构叫做： （1）摇动式切片机，（2）轮转式切片机，（3）滑动式切 片机，（4）推动式（雪橇式）切片机，（5）冰冻切片机。
• 最常用的是轮转式切片机。
切片机
切片机
• 轮转式切片机：系借转动手摇轮进行切片动作。是靠旋转一个重轮， 带动螺纹轴或齿轮，将组织块夹具向前推进，并在上下平面摆动；推 动的距离靠一个有刻度的调节器控制，每一梯度为1或2微米。
切片技术
石蜡切片
• 以石蜡制作的切片，可以制成极薄的切片。一般的切片厚 度要求在4—6微米，而石蜡切片不但可以达到这个要求， 甚至可以切得更薄到2微米以至1微米。另外，石蜡切片还 便于制作大批的或是连续的切片，而且以石蜡包埋的组织 块便于长期保存，所以石蜡切片是目前各种切片制作方法 中最普遍常用的一种方法。
操作方法及步骤
• ①取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者 难以切完整，最好为24×24×2mm。 • ②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台 上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一 个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。 • ③将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动 旋钮，将组织修平。 • ④调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切， 纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。
操作方法及步骤
• ⑤调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求 操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位臵。切片时，切 出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持 刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。
• ⑥应视不同的组织选择不同的冷冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主要 根据不同的组织而定，不能一概而论。如：切未经固定的脑组织，肝 组织和淋巴结时，冷冻箱中的温度不能调太低，在-10- -15℃左右， 切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时，可调在-15～20℃左右，切带脂 肪的组织时，应调至-25℃左右，切含大量的脂肪时，应调至-30℃。
切片的注意事项
• 切片质量的好坏，除与技术熟练程度和切片机的好坏有关外，切片刀 是决定的因素，刀一定要磨得十分锋利。否则在切片时会自行卷起或 皱起，或将组织划伤出现刀痕，更不能顺利地将切片切成连续地长条 带状。切片刀如有缺口存在，将使制成的切片断裂、破碎，不完整， 切片时应时时擦净刀口。 • 切片机的各个零件和螺丝应旋紧，否则将会产生震动。在切制切片的 开头阶段如出现切制不良与其他故障，最常见的原因是蜡块或切片刀 的松动所致。 • 摇动切片机时，用力要求均匀一致，不宜过重过猛，否则可因用力过 重而使机身震动，造成切片厚薄不均。遇有硬化过度的脑、肝、脾等 组织时，应该轻轻切削，以防组织由于震动形成空洞现象。 • 在夏秋季节进行切片时，应使用冰块加强冷却，这样不仅可保持石蜡 的硬度，同时也减少了切片的褶皱，给切片制作带来方便。
• 须注意的是，制作冰冻切片时，不但要使组织块冷冻，同时还应是切 片刀冷冻（如利用喷散的多余液体CO2或半导体致冷装臵使刀降温）。
• 这两种冷冻装臵以半导体冷冻装臵使用方便，但需电源和水源。
冷冻切片机
• 该机的箱面上有电子控制板，装有即时冷冻键和除霜键，启动即时冷 冻键，机器马上进行工作状态。启动即时除霜键，可将工作间顶部后 面的制冷栅上的霜除掉。有照明键一个，启动该键可照明工作间，有 利工作及观察组织的冰冻状况。 • 除此之外，箱面的左边有四个按键，两个为快速自动进退键，两个为 微小进退键，还有一个手动旋钮，调节修组织块时的进退。 • 冷冻箱内左边的冷冻台，温度可达-60℃左右，冷冻箱的中间为一台 切片机，工作间的温度在0-30℃间可任意调节，并在箱面上的荧屏显 示出来。
德国莱卡恒温箱冷冻切片机
冷冻切片机工作原理
• 这并非特殊类型的切片机，只不过组织块承托台改换成急速冷冻（约 零下20～30℃）装臵。这种急速冷冻装臵可以有两种形式：一为通过 液体CO2，在液体CO2蒸发时，急速吸收大量热而使组织块很快冷冻。 另一种为半导体致冷装臵，借半导体元件电偶作用急速使组织承托台 降温，在１～2分钟内也能达到组织冻结的目的。
切片前的准备
• 恒温水浴锅首先预热至35℃—40℃。 • 蜡块整修，将蜡块组织面的石蜡用刀修去，使组织全部暴 露出切面并修平，以减少切片刀的磨损。 • 将锋利的刀片装入切片刀夹钳内，调整角度和位臵后随即 紧固，检查切片刀的倾斜度是否正确，倾角过大、则切片 上卷；倾角过小则切片皱起，以20°-30°为佳。 • 准备好载玻片、小型毛笔、小型无钩镊子、铅笔。
冰冻切片的快速染色法
• • • • • • • ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ 切片固定30秒－1分钟。 水洗。 染苏木素3－5分钟。 分化。 于碱水中返蓝20秒。 伊红染色10－20秒。 脱水，透明，中性树胶封固。
• 冰冻组织1－2分钟，切片1分钟，固定1分钟，染色共五分钟。总共在 10分钟内完成快速制片过程，结果与石蜡切片不相上下。
缺点
• 1．不容易做连续切片。 • 2．切取的组织不能过大，组织过大不容易冻结或者组织冻结不均， 影响切片及染色效果。 • 3．不容易制作较薄的切片。 • 4．组织块在冻结过程中容易产生水的结晶而影响细胞的形态结构及 抗原物质的定位，片
• 冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法，二氧化 碳冰冻切片法，甲醇循环制冷冰冻切片法等。
主要应用于：
• 用于有些水解酶如ATP酶，琥珀酸脱氢酶等的定位的组织化学方法以 及免疫组织化学方法等。 • 用于证明脂肪及类脂和神经组织髓鞘的染色时的切片，这常见于某些 病例如脂肪瘤及肉瘤，某些科研组织等。 • 用于临床手术的快速病理诊断。 • 神经病理学技术中的某些染色法如：Eager氏法，Marchi氏法，Cajal 氏法，Hortega氏法和Holzer氏法等。 • 对某些物质所进行的免疫荧光的研究。
切片的步骤
• 将蜡块固定于切片机头上的夹座内，调整到稍离开切片能够切到的位 臵上，注意蜡块组织切面与切片刀口要垂直平行。 • 再调整蜡块组织切面恰好与刀口接触，旋紧刀架，固定好机头。 • 根据需要调整切片厚度。 • 摇动切片机手轮先进行修整切片，直到切出完整的最大组织切面后， 再进行切制。
切片的步骤
贴片（捞片）
• 待切片在恒温水内充分摊开展平后，将载玻片垂直插入水中，以做过 防脱处理的一面轻靠切片，将玻片直立提起，趁玻片上仍有少量水份 时用毛笔，拨正切片位臵。如组织较小，可在玻片上多贴几片或几排， 但排列应密集、整齐。
烤片
• 用铅笔在玻片一端的毛玻璃上写上标本编号，字要写得小而清楚、端 正。 • 将附贴好的切片臵于60℃恒温箱内干燥2-8小时，使切片牢固地贴附 于载玻片上即可进行染色。
• 实践中可用右手转动切片机手轮，左手用毛笔托起蜡片，协调地进行 切片操作。 • 切下的切片带，一端用镊子轻轻拉起，应尽可能将切片带拉直展开， 用毛笔将切片带从刀口向上挑起，拉下切片带，然后轻拖铺于恒温水 面上。 • 将单张或数张切片，用镊子夹住蜡片的一边并提起，铺于恒温水中 （光亮的一面朝下），立即用毛笔轻轻拉展，以切片无皱褶为最好。 如有皱褶时用镊子细心地逐个轻轻拨开，注意不可拨破组织。然后分 开每张切片，选取其中最完整的，没有皱褶的切片。