1 冰冻切片4~8um，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟（另：丙酮先在-20C预冷,然后在4C固定片子15分钟,固定后在室温下干燥后再做免疫组化），PBS洗，5分钟×3。

2 用3％（另0.3%）过氧化氢孵育5~10分钟（另：最好是用3%H2O2/甲醇溶液，室温20分钟。

此配方不易产生脱片。

配制方法是在9ml甲醇中加30%H2O2 1ml，混匀后使用，每次新鲜配制），消除内源性过氧化物酶的活性。

PBS洗，5分钟×2。

3 5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。

倾去血清，勿洗，
4 滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。

5 回收一抗，PBS冲洗，5分钟×3次。

6 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。

7 PBS冲洗，5分钟×3次。

8 显色剂显色（DAB或AEC）。

10 自来水充分冲洗，复染，封片。

如果你的组织曾放在多聚甲醛中固定的话，建议还是抗原修复效果比较好，如果没在甲醛中浸泡，无需抗原修复。

如果你的片子切完后在冰箱中保存的话，做之前，从冰箱取出后先室温半小时，然后入37℃烤箱一小时，再进行免疫组化实验，掉片现象会少一点。

我们以前片子从-20℃取出后，接着就做免疫组化，片子掉得很多。