五、实验方法和步骤
1．取材：取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后，除 取材：取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后， 叶梗及粗脉，剪成0.5x0.5cm小块。 0.5x0.5cm小块 叶梗及粗脉，剪成0.5x0.5cm小块。 匀浆：将称取60g 60g叶片小块放入组织捣碎机套 2．匀浆：将称取60g叶片小块放入组织捣碎机套 筒内，加入200ml SNT溶液 匀浆20 溶液， 20秒 筒内，加入200ml SNT溶液，匀浆20秒(最高 速度)制成匀浆液。 速度)制成匀浆液。 过滤：将匀浆液经四层纱布过滤， 400目尼 3．过滤：将匀浆液经四层纱布过滤，或400目尼 龙网过滤，滤液分装离心管，平衡。 龙网过滤，滤液分装离心管，平衡。
三、实验用具和试剂
1/3000中性红染液 中性红染液: ③ 1/3000中性红染液: 称取0.5中性红溶于50ml Ringer溶液 0.5中性红溶于 溶液， 称取0.5中性红溶于50ml Ringer溶液， 稍加热（30~400C）使之很快溶解， 稍加热（30~400C）使之很快溶解，用滤纸过 装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀， 滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀， 失去染色能力。 失去染色能力。 临用前，取已配制的1%中性红溶液1ml 1%中性红溶液1ml， 临用前，取已配制的1%中性红溶液1ml， 加入29ml Ringer溶液混匀 装入棕色瓶备用。 溶液混匀， 加入29ml Ringer溶液混匀，装入棕色瓶备用。 ④ 香柏油 材料： 3．材料：新鲜菠菜
叶肉细胞
细胞核
活细胞及细胞核
叶绿体
绘图参考
提示： 提示：下次实验为 实验五 细胞膜的通透性 实验六 细胞凝集反应
六、实验结果
1．在普通光学显微镜下，在悬浮液1滴片中可以看到含细胞核 在普通光学显微镜下，在悬浮液1 和大量叶绿体的叶肉细胞 叶肉细胞（ 和大量叶绿体的叶肉细胞（形态为球形或椭圆形的原生质 体）。 在普通光学显微镜下，在悬浮液2滴片中可以看到细胞核 2．在普通光学显微镜下，在悬浮液2滴片中可以看到细胞核 形态为球形）。 （形态为球形）。 在普通光学下，在悬浮液1 滴片中性红染色可以鉴别活细 3．在普通光学下，在悬浮液1、2滴片中性红染色可以鉴别活细 胞及细胞核（中性红是液泡系特殊的活体染色剂， 胞及细胞核（中性红是液泡系特殊的活体染色剂，在细胞处 于生活状态时，中性红只将液泡染成红色， 于生活状态时，中性红只将液泡染成红色，而细胞质及细胞 核不着色。如果细胞死亡，红色会弥散在整个细胞中）。 核不着色。如果细胞死亡，红色会弥散在整个细胞中）。 在普通光学显微镜下，在悬浮液3滴片中可以看到叶绿体 4．在普通光学显微镜下，在悬浮液3滴片中可以看到叶绿体 叶绿体为绿色椭圆形， （叶绿体为绿色椭圆形，在高倍镜下可以看到叶绿体内部含 有较深的绿色小颗粒，即基粒）。 有较深的绿色小颗粒，即基粒）。
四、实验内容
1．组织匀浆液的制备（组织捣碎法）。 组织匀浆液的制备（组织捣碎法）。 细胞及细胞器（细胞核、叶绿体等） 2．细胞及细胞器（细胞核、叶绿体等）的分 纯化（离心分离法）。 离、纯化（离心分离法）。 细胞、细胞核、叶绿体的镜检（根据形态、 3．细胞、细胞核、叶绿体的镜检（根据形态、 大小、分布位置、数量识别法）。 大小、分布位置、数量识别法）。 分离细胞活性的鉴别（ 4．分离细胞活性的鉴别（中性红活体染色 法）。
二、实验原理
细胞器的分离是研究细胞器的结构、 细胞器的分离是研究细胞器的结构、功能和化学 组成的技术基础，保持分离的细胞器的纯度、 组成的技术基础，保持分离的细胞器的纯度、结 构完整及其生理、生化活性是本实验的三大要素。 构完整及其生理、生化活性是本实验的三大要素。 细胞核是植物细胞中最大、最重要的细胞器， 细胞核是植物细胞中最大、最重要的细胞器，使 细胞各种生命活动的指挥中心。 细胞各种生命活动的指挥中心。叶绿体是植物细 胞进行光合作用，将光能转变成化学能的重要细 胞进行光合作用， 胞器。由于它们的重要功能， 胞器。由于它们的重要功能，所以它们一直是细 胞生物学、遗传学、 胞生物学、遗传学、和分子生物学研究的重要对 利用离心技术可分离、纯化细胞、 象。利用离心技术可分离、纯化细胞、细胞核和 叶绿体。 叶绿体。
5．悬浮：分别收集沉淀，用少量的SNT溶液 悬浮：分别收集沉淀，用少量的SNT溶液 SNT 分别将沉淀1 悬浮。 分别将沉淀1、2、3悬浮。 镜检： 6．镜检： 取悬浮液1 分别做滴片镜检。 ① 取悬浮液1、2分别做滴片镜检。 然后加几滴中性红染色5 10min， 然后加几滴中性红染色5-10min，盖 上盖玻片镜检。 上盖玻片镜检。 取悬浮液3做滴片盖上盖玻片， ② 取悬浮液3做滴片盖上盖玻片，用油镜 观察。 观察。
三、实验用具和试剂
1．仪器：组织捣碎机、高速冷冻离心机、托盘天平、 仪器：组织捣碎机、高速冷冻离心机、托盘天平、 普通光学显微镜、剪刀、培养皿、250ml烧杯 烧杯、 普通光学显微镜、剪刀、培养皿、250ml烧杯、量 玻璃漏斗、移液管、离心管、滴管、滤纸、 筒、玻璃漏斗、移液管、离心管、滴管、滤纸、 纱布一大块或400目尼龙网、载玻片、盖玻片。 400目尼龙网 纱布一大块或400目尼龙网、载玻片、盖玻片。 SNT溶液 0.4M蔗糖 溶液： 蔗糖、 2．试剂：① SNT溶液：0.4M蔗糖、0.01M NaCl 试剂： ② 0.05M Tris-HCL缓冲液 ： Tris-HCL缓冲液 Tris（ 0.2M Tris（三羟甲基氨基甲烷） 50ml 500.1N HCL 50-55ml 两液混匀后，加蒸馏水至200ml 200ml， 两液混匀后，加蒸馏水至200ml，pH7.6
八、实验作业
1.绘制出一个完整的叶肉细胞图（内含细胞核、叶绿体） 1.绘制出一个完整的叶肉细胞图（内含细胞核、叶绿体）。 绘制出一个完整的叶肉细胞图 2.得到结构真实、完整并具生理、 2.得到结构真实、完整并具生理、生化活性的细胞器应注 得到结构真实 意哪些问题？谈谈SNT溶液中的各种成分的作用。 意哪些问题？谈谈SNT溶液中的各种成分的作用。 SNT溶液中的各种成分的作用 3.分离各种细胞器所需的相对离心力与哪些因素有关？ 3.分离各种细胞器所需的相对离心力与哪些因素有关？ 分离各种细胞器所需的相对离心力与哪些因素有关 4.对你设计的实验的成败谈谈感想，提出改进的措施。 4.对你设计的实验的成败谈谈感想，提出改进的措施。 对你设计的实验的成败谈谈感想 5.做哪些研究需要分离制备叶绿体？ 5.做哪些研究需要分离制备叶绿体？ 做哪些研究需要分离制备叶绿体
4．离心： 滤液 离心： 200× 1000rpm/分 ↓200×g（1000rpm/分）1分 ________________________ ↓ ↓ 沉淀1 上清,平衡, 沉淀1 上清,平衡,离心 含叶肉细胞） 500× 1500rpm/分 （含叶肉细胞） ↓500×g（1500rpm/分）1分 ↓ ↓ 沉淀2 含细胞核） 上清,平衡, 沉淀2（含细胞核） 上清,平衡,离心 1000× 3000rpm/分 ↓1000×g（3000rpm/分）5分 ↓ ↓ 沉淀3 上清， 沉淀3 上清，弃 含大量叶绿体） （含大量叶绿体）
二、实验原理
将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心， 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离 等渗介质中进行差速离心 各种细胞器的常用方法。 各种细胞器的常用方法。颗粒在离心场中的沉降速率取决于 颗粒的大小、形状和密度， 颗粒的大小、形状和密度，也与离心力以及悬浮介质的粘度 有关。在一给定的离心场中，一定时间内， 有关。在一给定的离心场中，一定时间内，密度和大小不同 的颗粒其沉降速率不同，依次增加离心力和离心时间， 的颗粒其沉降速率不同，依次增加离心力和离心时间，能使 非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心 非均一悬浮液中的颗粒按其大小、 管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分， 管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分，最先沉淀的是 细胞，其次是细胞核，接下来是叶绿体。 细胞，其次是细胞核，接下来是叶绿体。 悬浮介质通常用缓冲的等渗溶液，它与细胞质的分散相 悬浮介质通常用缓冲的等渗溶液， 缓冲的等渗溶液 接近，在一定程度上能保持细胞器的真实结构和酶的活性 能保持细胞器的真实结构和酶的活性。 接近，在一定程度上能保持细胞器的真实结构和酶的活性。
பைடு நூலகம்
七、实验注意事项
• 得到结构真实、完整并具生理、生化活性的细 得到结构真实、完整并具生理、 胞器应注意的问题？ 胞器应注意的问题？ 1．细胞和各种细胞器的分离应在等渗溶液中 进行， 进行，以免渗透压的改变使细胞和细胞器 的受到损伤。 的受到损伤。 要注意整个实验的分离过程必须在0 2．要注意整个实验的分离过程必须在0～5℃ 的条件下进行，避免酶的失活； 的条件下进行，避免酶的失活；如果在室 温下，要迅速分离和观察。 温下，要迅速分离和观察。 离心过程中要注意离心力和离心时间。 3．离心过程中要注意离心力和离心时间。
实验四
植物叶片活细胞和叶绿体的 分离提取及观察
College of Life Science and Technology, XINJIANG Univercity
一、实验目的
初步掌握运用机械法分离活细胞和细胞器 的方法； 的方法； 掌握运用差速离心或密度梯度离心分离纯 化叶肉细胞，细胞核，叶绿体的方法； 化叶肉细胞，细胞核，叶绿体的方法； 掌握分离的细胞的活性鉴别方法； 掌握分离的细胞的活性鉴别方法； 熟悉叶肉细胞或原生质体、细胞核、 熟悉叶肉细胞或原生质体、细胞核、叶绿 体的形态大小。 体的形态大小。