高中生物课程中常见染色剂染色原理及使用注意事项朱秋霖，马天兵兰州二中，兰州 730000 摘要：目的：探究高中生物试验中常见染色剂的使用方法及常见问题与注意事项方法：通过一些简单的实验验证与参考文献得出结论。

结果：验证与总结出生物试验中常见染色剂的染色原理及所遇到的染色问题的原因。

关键词：高中生物学实验染色剂显色原理注意事项The common dye staining principle and precautions in the highschool biology curriculumZhu Qiulin，Ma TianbingLanzhou NO.2 middle secondary school class8 grade2，lanzhou 730000Abstract:Objective: To explore the use of high school biology test stains and FAQs Notemethod: through some simple experiments verify references concluded.Results:Validation andsummed up a common biological test stain dyeing principle and coloring problem encountered byreason.Keywords:high school biology experiment stain color rendering principle Precautions1.常见染色剂常见的高中生物染色显色反应，其实质是化学反应或者物理反应，按照其反应本质，可分为下列几类[5]：1.1 氧化还原反应类染色剂通过氧化还原反应生成某些具有特殊颜色的物质，利用其与生物组织中某些具有还原性的物质或代谢产物进行化学反应，宏观上产生颜色变化，通过颜色变化,鉴别某些生物组织中的目标物质。

1.1.1 斐林试剂由于生物组织中的葡萄糖，果糖和麦芽糖等含有具有还原性的醛基，因此称其为还原性糖[1]。

利用斐林试剂，与还原糖发生还原反应，生成砖红色沉淀。

利用这一性质，可鉴定生物组织液中的还原性糖的存在与否，亦可以用来分析糖尿病人尿液成分。

配方为2.5mol/L的氢氧化钠溶液（甲液）；约0.31mol/L的硫酸铜溶液（乙液）。

其化学反应原理如下所示：2CH3(CH2OH)4CHO + 2Cu(OH)2→ 2CH3(CH2OH)4COOH + Cu2O↓ + 2H2O当甲乙两液混合后，立即生成蓝色的氢氧化铜沉淀（Cu(OH)2）。

Cu(OH)2与随后加入的还原性糖类在加热的条件下，会被还原性糖中的醛基还原成为砖红色的氧化亚铜（Cu2O）沉淀，从而鉴定还原糖。

1.1.2 班氏试剂班氏试剂亦是用以鉴定鉴别糖类物质的染色显色剂，但常用于尿糖的定性检测[3]。

常见配方如下：17.4克无水硫酸铜（CuSO4）溶解于100毫升热蒸馏水中，冷却后，稀释到150毫升。

称取柠檬酸钠173克与无水碳酸钠（Na2CO3）100克，加入蒸馏水600毫升，加热溶解。

冷却后，稀释到850毫升。

把硫酸铜溶液倾入柠檬酸钠及碳酸钠溶液中，搅匀后即为班氏尿糖定性试剂。

1.1.3 重铬酸钾酵母菌无氧呼吸产生乙醇，可用重铬酸钾（俗称红矾钾，分子式K2Cr2O7）溶液进行鉴定鉴别。

其染色显色过程中的化学反应方程式如下所示：3CH3CH2OH + 2K2Cr2O7 + 8H2SO4 → 3CH3COOH + 2Cr2(SO4)3 + 2K2SO4 + 11H2O橙色的重铬酸钾在酸性的条件下，与醇类反应，被还原成为灰绿色的硫酸铬。

从而用以鉴别醇类物质。

1.2 络合物（配合物）类染色显色剂络合物（又称配合物），是由可以给出孤对电子或多个不定域电子的一定数目的离子或分子（配体），和具有接受孤对电子或多个不定域电子的空位的原子或离子（统称为中心原子），按照一定的组成和空间构型所形成的化合物。

这类物质吸收光后，自身产生变化，光照消失后恢复原样，从而产生颜色变化。

1.2.1 碘，碘的乙醇溶液1864年德国科学家萨克斯在分析光合作用产物时，就利用了碘可以用于检测淀粉的性质（反应）。

直链淀粉由α-葡萄糖分子缩合而成螺旋状的长长的螺旋体，每个葡萄糖单元都仍有羟基暴露在螺旋外，碘分子跟这些羟基作用，使碘分子嵌入淀粉螺旋体的轴心部位，两者形成一种蓝黑色络合物。

实验证明，单独的碘分子不能使淀粉-)。

这并非是淀粉与碘发生了化学反变蓝，实际上使淀粉变蓝的是碘分子离子(I3应，而是淀粉螺旋中央空穴恰能容下碘分子。

支链淀粉遇碘呈紫红色，淀粉跟碘显色结果，与淀粉的聚合度或相对分子质量有关。

1.2.2 双缩脲试剂双缩脲试剂用于鉴定蛋白质,为碱性含铜试液，呈蓝色。

由1%氢氧化钾、1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。

当底物中含有肽键时，试剂中的铜与多肽物质配位反应，配合物呈紫色。

双缩脲试剂中主要作用物为硫酸铜，而氢氧化钾仅仅是为了提供碱性环境，因此它可被其他碱如氢氧化钠所代替。

向试剂中加入碘化钾，可延长试剂的使用寿命。

双缩脲鉴定多肽物质（包括蛋白质）的反应原理：双缩脲（H2NOC－NH－CONH2）是有2个分子尿素在加热后放出一分子氨后得到的产物[1]。

在强碱性环境中，双缩脲与硫酸铜（CuSO4）作用，形成紫红色络合物，该反应即双缩脲反应。

双缩脲反应是肽和蛋白质所特有的，而为氨基酸所没有的一种颜色反应。

一般分子中含有两个肽键的化合物与碱性铜溶液作用，就会形成紫色或蓝紫色络合物。

但是需要注意的是，除了-CO-NH-有此反应外，（-CONH2-）、（-CH2-）、（-NH2-）、（-CS-CS-NH2）等基团亦有此反应。

1.3 有机染色剂染色[6]利用有机染色剂染色的必备条件是具有颜色并且与被染物质之间有强的亲和力。

1.3.1 苏丹染色剂目前常见的染色剂为苏丹Ⅲ与苏丹Ⅳ染色剂。

苏丹Ⅲ与苏丹Ⅳ是人工合成的苏丹系列染色剂，常作为工业染色剂。

苏丹染色剂为亲脂性偶氮化合物，在脂肪类物质中的溶解度大于在其他溶质（酒精、丙酮）中的溶解度时，染色剂颗粒便在脂肪颗粒中大量积累，并呈现橘黄色或红色。

1.3.2 甲基绿、吡咯红、二苯胺在观察细胞中DNA和RNA的分布时，需要用甲基绿和吡罗红染色。

甲基绿是具有金属光泽的绿色结晶，溶于水，呈现蓝绿色。

在盐酸中显示红黄色，在碱性溶液中显示为无色。

在进行DNA的鉴别鉴定中，使用其对DNA进行染色显色。

吡咯红是含有氮原子的杂环化合物，与RNA结合呈现红色。

DNA在酸性条件下加热，生成嘌呤碱基，脱氧核糖与脱氧嘧啶核苷酸，其中，脱氧核糖在酸性条件下加热，发生脱水反应，并生成ω-羟基-γ-酮基戊糖，与二苯胺（分子式C12H11N）反应，生成蓝色物质。

1.3.3 龙胆紫、醋酸洋红、刚果红龙胆紫与醋酸洋红用于细胞染色体的染色显色反应，在观察植物细胞有丝分裂时经常用来使染色质或染色体着色。

龙胆紫的稀溶液俗称紫药水，虽然在使用龙胆紫溶液染色时，溶液略显酸性，但因为其具有碱性基团，故其为一种碱性阳离子染色剂。

醋酸洋红（胭脂红、卡红）中的醋酸，是该染色剂的溶质。

醋酸增加了染色时细胞的通透性，利于洋红进入细胞核对染色体进行染色。

刚果红（棉红、直接大红、直接朱红）可以使纤维素直接着色的一种偶氮化合物染色剂。

1.4 酸碱指示剂类酸碱指示剂是一类结构复杂，但使用简单的弱有机酸或碱。

它们在溶液中能够部分电离，并且由于结构发生变化，导致其粒子的颜色发生变化，因而在不同的pH环境下呈现不同的颜色。

生物学实验中常用的酸碱指示剂有溴麝香草酚蓝的水溶液和酚红。

高中生物课程实验中“探究酵母菌的呼吸方式”，可以用溴麝香草酚蓝的水溶液来鉴定是否有二氧化碳的生成。

由于酵母菌无氧呼吸生成的二氧化碳并与水反应生成碳酸呈弱酸性，所以由蓝变黄，其中间过渡色为绿色。

酚红为有机弱酸，变色范围为6.8至8.0由黄变红。

可用来检测尿素分解细菌的产物——氨（在溶液中为铵）2. 常见问题及注意事项2.1为什么经常碘遇淀粉不变蓝？课本中经常提及淀粉遇碘变蓝，可是在中学生物或化学实验中，经常见到淀粉遇碘不呈现蓝色，而是呈现紫色或其他颜色。

中学生甚至教师经常被这个问题所困扰，究其原因，主要是因为淀粉的结构及实验条件如温度、PH值等所导致的。

淀粉为白色粉末，由10%～30%的直链淀粉和70%～90%的支链淀粉组成。

溶于水的直链淀粉借助分子内的氢键卷曲成螺旋状。

如果加入碘液，碘液中的碘分子便嵌入到螺旋结构的空隙处，并借助范德华力与直链淀粉分子联系在一起，形成了一种络合物。

在此络合物中，淀粉链以直径0.13 pm绕成螺旋状，碘分子处在螺旋的轴心部位，淀粉与碘生成的包合物的颜色，跟淀粉的聚合度或相对分子质量有关。

在一定的聚合度或相对分子质量范围内，随聚合度或相对分子质量的增加，络合物的颜色的变化由无色、橙色、淡红、紫色到蓝色。

例如，直链淀粉的聚合度是200～980或相对分子质量范围是32，000～160，000时，络合物的颜色是蓝色。

分支很多的支链淀粉，在支链上的直链平均聚合度20～28，这样形成的包合物是紫色的。

支链淀粉部分水解可产生称为糊精的混合物。

糊精的聚合度更低，显棕红色、红色、淡红色等。

除结构外，还有以下因素也会影响：①温度：随着温度的升高, 淀粉溶液与碘显色的灵敏度降低, 且当温度高于45℃时此显色反应现象几乎看不到。

这是因为直链淀粉与碘显色的实质是直链淀粉的螺旋状圆柱刚好能容纳碘分子的钻入, 并受范德华引力吸引而形成络合物, 加热时络合物离解,碘分子从络合物中脱下，所以蓝色褪去；而冷却后, 脱下来的碘分子又逐渐与淀粉结合而再显蓝色。

② pH值：在不同的pH 值溶液中显色情况是不同的。

淀粉与碘的蓝色蓝色反应在pH= 3-5 的弱酸性溶液中进行最灵敏, 在pH小于8的弱碱性溶液中次之；在强酸性溶液中, 反应呈现蓝紫色；在pH大于9的碱性溶液中不显色。

发生上述不同显色反应的原因是：淀粉在强酸中会水解, 产生糊精等, 糊精和碘分子作用呈现红色, 在与深色的碘单质混合后，则呈现蓝紫色; 在强碱性溶液中, 碱将歧化成次碘酸盐和碘化物, 基本无单质碘的存在, 因而不显色; 在弱酸性溶液中, 碘基本不参与歧化反应, 所以单质碘数量多, 有利于与淀粉结合, 故显色反应比较明显。

③淀粉的新鲜程度：淀粉溶液越新鲜, 显色反应越明显。

配好的淀粉溶液放置的时间不同, 与碘分子作用时显示的颜色也有所不同。

淀粉溶液存放时间越长, 呈现的紫色越明显。

这是因为淀粉水溶液会缓慢地水解,为糊精等物质, 糊精与碘作用显红色, 因而久置的淀粉溶液会降低反应的灵敏度, 而且反应呈蓝紫色, 甚至紫红色。