• 序列比对的目的：
– 从核酸以及氨基酸的层次去分析序列的相同点 和不同点，以推测他们的结构、功能以及进化 上的联系
– 通过判断两个序列之间的相似性来判定两者是 否具有同源性
• 相似性：直接的数量关系，如：序列之间相似部分 的百分比 • 同源性：质的判断，两个基因在进化上是否曾有共 同祖先的推断
本地运行BLAST
树上的数字为Bootstrap 校验值，表示该分支通过 Bootstrap校验的次数占 总次数的百分比，该数值 越大，即表示构建进化树 的可信度越高；大于70的 Bootstrap值较为可信。
由核酸酶蛋白序列构建的系统进 化树基本反映了这些物种的亲缘 关系；在人和黑猩猩等亲缘关系 较近的物种中胰腺核酸酶基因只 有一个拷贝。而叶猴胰腺核酸酶 有两个拷贝紧密聚类在一起，推 测是由于种内基因重复产生； leaf monkey 2树枝长度远大于 leaf monkey1，表明该拷贝蛋白 质序列发生了快速变化。
例：blastall -p blastx -d db -i in -o out -e 2e-5 -m 9 (表格显示比对结果)
采用blastx程序，将in中的序列到数据库bd中进行比对， 结果以表格形式输入到out文件
上机实习2:本地运行blastx
• • • • 进入DOS命令行提示符状态（“运行”cmd） 进入C盘“cd\” 进入包含序列数据的bin目录下“cd Blast\bin” 察看目录下内容“dir”
• blastall常用参数
四个必需参数 -p program_name,程序名，根据数据库及搜索文件序列性质进行选择； -d database_name,数据库名称,比对完成格式化的数据库； -i input_file,搜索文件名称； -o output_file,BLAST结果文件名称； 两个常用参数 -e expectation，期待值,默认值为10.0，可采用科学计数法来表示，如2e-5； -m alignment view options:比对显示选项，其具体的说明可以用以下的比对实例说 明
输入“more db”-〉回车察看db文件内容
输入“formatdb -i db -p T”-〉回车 对db数据库进行格式化
输入“dir”-〉回车 察看bin文件夹下内容
格式化以后产生的文件
输入“blastall -p blastx -i in -d db -o out -e 2e-5 -m 9” -〉回车 运行blastx程序
·
下载ClustalX 各种参数设定
目标序列
Jalview 结果下载
本地运行ClustalX
17-RNASE1.fasta • 多序列比对
– （Multiple Alignment）
在C:\Program Files\ClustalX2 文件夹下，找到clustalx.exe 双击打开
Clustalx窗口
ClustalW/X的运行
• 本地运行
– 命令行操作的Clustal W（linux & windows)
– 窗口化操作的ClustalX（windows）
下载页面： ftp:///pub/software/clustalw2/2.1/ • 欧洲生物学中心（EBI）还提供了Clustal W的网上 运行服务（/clustalw)
点击File下拉菜单中 Load sequences选项， 打开序列文件17-RNASE1.fasta.txt
打开后的界面
点击进行多序列比对
可在Alignment下拉菜单中的Alignment Parameters中设定各个参数
点击Alignment下拉菜单中的Do Complete Alignment进行比对
双击安装到C盘 产生三个文件夹 •bin •data •doc
将数据库文件(db)及目标序 列文件(in)保存在Blast/bin 文件夹下
本地数据库的构建
• 查看db文件
由fasta格式的序列组成
数据库的格式化
formatdb命令用于数据库的格式化： formatdb [option1] [option2] [option3]…
BootstrapMethod 从排列的多序列中随机有放回的抽取某一列， 构成相同长度的新的排列序列 重复上面的过程，得到多组新的序列 对这些新的序列进行建树，再观察这些树与原 始树是否有差异，以此评价建树的可靠性
至少进行100次重复取样
原始数据多 序列比对结果 对序列中每个 位置重复抽样， 基于原比对结果 生成多个样本
formatdb常用参数 -i database_name 需要格式化的数据库名称 -p T\F 待格式化数据库的序列类型 （核苷酸选F；蛋白质选T；默认值为T)
例：formatdb -i db -p T
对蛋白质数据库“db”进行格式化
程序运行
blastall命令用于运行五个blast子程序: blastall [option1] [option2] [option3] *可在dos下输入blastall查看各个参数的意义及使用
长方形树可对物种 间隔、分支长度及 树宽度等项进行调 整。
环形树可设置起始 角度、半径长度、 中心空洞等参数。
放射形树可设置树 枝长度、起始角度 等参数。
Branch 中可调 整线条粗细、显 示统计值、对树 枝位置、离节点 距离及长度等。
Labels中可以设 定显示物种名称 及其标记不同的 形状或颜色。
比对结果 “*”、“:”、“.” 和空格依次代表改位点的序列一致性由高 到低
分子进化遗传分析工具（MEGA 5）
• MEGA5 适用于构建进化树，挖掘数据库信 息，估计分子进化率，推断祖先序列等项 目。该工具包能基于网络数据库，检索、 获取序列数据，进行序列比对；然后通过 编辑和整理，制作出样式精美的树形图。
Scale栏对标尺 长度及线条粗细 进行设置。
Cutoff设定 Bootstrap的阈 值。当点击菜单 中的 Comput→“Con densed Tree”构 建密集树时，小 于此数值的分支 则都合并到大分 支中。
进化树文件的保存
进化树图像的保存
输入“cd\”-〉回车 回到安装目录C盘
输入“cd blast\bin”-〉回 车 到达blast程序下bin文件夹
输入“dir”-〉回车 察看bin文件夹下内容
bin文件夹下包含 以.exe为后缀的程序 文件以及需要用到 的数据可文件“bd” 和目标序列文件“in”
•空格键翻页 •输入“q”跳出
多序列比对的应用： •系统发育分析(phylogenetic analysis) •结构预测(structure prediction) •序列基序鉴定(sequence motif identification) •功能预测(function prediction) ClustalW/ClustalX：一种全局的多序列 比对程序，可以用来绘制亲缘树，分析进化 关系。 MEGA5
• UPGMA 除权配对法 以上5种方法原理不同，但构建方法基本一致。通常对 分化程度较大的远缘序列选择ML、NJ、ME，近缘序 列可采用MP或UPGMA。
空位罚分，该分值越高，序列联培中空 位越少 空位延伸罚分，该分值越高，序列联培 中空位越短 蛋白序列匹配权重矩阵类型
进化树的可靠性分析
构建系统进化树
• MEGA5 工具栏中的Phylogeny提供5种常用系统进化 树的构建方法： • Maximum Likelihood, ML最大似然法 • Neighbor-Joining，NJ 临位连接法 • Minimum-Evolution，ME 最小进化法
• Maximum Parsimony，MP 最大简约法
• 格式化数据库db“formatdb -i db -p T”
• 运行blastx
输入
数据库类型：F/T
– “blastall -p blastx -i in -d db -o out -e 2e-5 -m 9 ”
Blast程序 序列输入 数据库 结果输出
• 察看结果“more out ”或在 windows下双击打
产生的结果文件“out”
用”more out” 察看结果文件
不使用–m参数时 比对结果显示序列两两比对
用”more out” 察看结果文件
多序列比对的 目的
• 从物种的一些分子特性出发，从而 了解物种之间的生物系统发生的关 系。
• 通过序列同源性的比较进而了解基 因的进化以及生物系统发生的内在 规律。
• 下载 （ftp:///blast/executa bles/blast+/LATEST/） • 安装（安装到C:\） • 数据库的格式化（formatdb） • 程序运行（blastall）
•bin含可执行程序(将数据库及需要比 对操作的数据放入该文件)； •data文件夹含打分矩阵及演示例子的 序列数据信息； •doc文件夹含关于各子程序的说明文 档。
ML
多种建树方 法的比较
NJ
MP UPEMA ME
MEGA 5 提供 了多种的树状 图表示方式供 选择。包括长 方形、直线形、 曲线形、辐射 形和环形
进化树树形的选择
进化树拓扑结构的调整
根位置的设定
翻转（Flip)
变换（Swap）标，出现树 枝形态选择 对话框，内 含5个选项， 分别是Tree、 Branch、 Labels、 Scale、 Cutoff