纤维素酶 ( Cellulase) 是使纤维素降解生成葡萄糖 的 1组酶的总称 , 包含 C1酶 、CX酶和 β2葡萄糖苷酶 , 这 3种酶协同作用可将纤维素降解为葡萄糖 [3, 4 ] 。纤维
收稿日期 : 2010203224 基金项目 : 四川省财政育种工程青年基金项目 (2008VJJ2018) 作者简介 : 康纪婷 (1984 - ) , 女 , 四川成都人 , 硕士在读 , 从事环境
现将其中具有代表性 、应用较为广泛的方法简介如下 :
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河北农业科学
2010 年
21111 棉线切断法 采用恒温振荡器 , 将细棉线的一 端浸入含有酶液的试管中 , 在最佳温度和 pH 值条件下 微振荡 。测定细棉线切断所需的时间 , 求得酶活力 。 21112 滤纸崩溃法 采用恒温振荡器 , 以一定规则的滤 纸片为底物 , 加入装有酶液的试管中 , 在最佳温度和 pH 值条件下微振荡。测定滤纸完全崩溃所需要的时间 , 求得 酶活力。由于滤纸崩溃的时间较难确定 , 所以误差很大。
微生物研究 。E2mail: kangjiting11zhong@yahoo. com. cn。 通讯作者 : 张小平 。
素酶是起协同作用的多组分酶系 , 可以促进纤维素的分 解 。纤维素酶主要来自于真菌和细菌 。按照其作用机 理 , 可分为内切葡聚糖苷酶 、外切葡聚糖苷酶和 β2葡萄 糖苷酶 3类 [5 ] 。 11211 内切葡聚糖苷酶 又称 Cx酶 、CMC 酶 、 endo2 1042β2D 2glucanase (来自真菌的简称 EG, 来自细菌的简 称 Cne) 。Cx酶作用于纤维素内部的无定型区域 , 随机 水解 1042β2葡萄糖苷键 , 将长链纤维素分子切短 , 产生 大量非还原性末端的小分子纤维素 。 11212 外切葡聚糖苷酶 又称 C1 酶 、 exo21042β2D2glu2 canase (来自真菌的简称 CBH, 来自细菌的简称 Cex) 。 C1酶作用于纤维素线状分子的末端 , 水解 1042β2D 2葡 萄糖苷键 , 每次切下 1个纤维二糖分子 , 又称纤维二糖 水解酶 ( cellobiohydrolase) 。 11213 β2葡萄糖苷酶 又称纤维二糖酶 、β21042gluco2 sidase (简称 BG) 。这类酶将纤维二糖或可溶性纤维糊 精水解成葡萄糖分子 。
3 纤维素酶活力测定存在的问题与展望
311 纤维素酶活力测定存在的问题 纤维素酶活力的测定方法有很多 , 至今也没有统
一 , 而且测定中存在着很多困难 , 给纤维素酶的开发利 用带来了很多不利影响 。其主要问题有 [6 ] : ( 1 ) 根据 酶反应动力学通则 , 酶活力的测定是在底物过量存在的 条件下 , 测定酶促反应的初速度来表示酶活力 。但纤维 素酶是多组分酶系 , 各组分间有协同作用 , 形成了多种 终产物 , 涉及多种反馈控制机理 。测初速度的原则也就 难以反映底物特性 , 使得确定酶活力测定的标准化方法 非常困难 。 (2) 纤维素是不溶于水的高聚糖 , 纤维素酶 与其反应是在固体界面上进行的 , 其酶解反应速率受底 物对酶蛋白的吸附速率和产物扩散速率的影响 。不同来 源的同一类纤维素酶 , 其组成和各组成成分的比例也有 较大的差异 , 使得测定结果存在较大的不准确性 。 ( 3) 由于纤维素酶结构的复杂性 , 酶组分生化特性和酶学作 用的影响 , 以及异构酶的存在 , 在不同试验条件下得到
摘要 : 关于纤维素酶活力测定方法很多 , 至今也没有统一 。国内许多单位根据各自的实验目的采用了不同的测 定方法 , 并据各自的经验对其做了部分修改 , 使得测定方法更加多样化 。综述了纤维素酶活力的测定方法及其 存在的问题 , 旨为不同目的纤维素酶活力测定方法的选择提供借鉴 。 关键词 : 纤维素酶 ; 酶活力 ; 测定方法 中图分类号 : TQ92011 文献标识码 : A 文章编号 : 100821631 ( 2010) 0420151203
河北农业科学 , 2010, 14 (4) : 151 - 153 Journal of Hebei Agricultural Sciences
编辑 李布青
纤维素酶活力测定方法
康纪婷 1 , 吴 翔 2 , 甘炳成 2 , 张小平 13
(11四川农业大学资源与环境学院 , 四川 雅安 625014; 21四川省农业科学院土肥所微生物实验室 , 四川 成都 610000)
近年来国内通用的和新提出的一些纤维素酶活力测 定方法 , 大多利用 DNS法原理 , 即纤维素经纤维素酶 水解后生成的还原糖能将 3052二硝基水杨酸 (DNS) 中 的硝基还原为氨基 , 生成棕红色的氨基化合物 。在一定 的浓度范围内 , 还原糖的量与棕红色的深浅呈正比关
系 [12 ] 。可用比色法测定 。 21211 内切纤维素酶活 ( CMCaseactivity) 以无定形 纤维素为底物 , 以还原糖的生成量表征 CMC 酶活力 。 如 Amano法采用了羧甲基纤维素钠 , 国际药品联合会提 供的测定方法采用了羟乙基纤维素 [14 ] , Merz法采用了 磷酸膨胀纤维素 [15 ] 。 21212 外切纤维素酶活 ( PNPCase) 以对硝基苯纤 维二糖苷 ( pNPC) 为底物 , 以对硝基苯的生成量表示 酶活力 [15 ] 。也可以微晶纤维素 (Avicel) 为底物水解得 到的还原糖量表示酶活力 , 称为 Avicelase 活力 。但内 切葡聚糖苷酶对 Avicel水解程度也高 , 对原酶液而言 , 它反映的是纤维素酶各组分协同作用的结果 ; 对单一组 分来说 , 它反映外切葡聚糖苷酶的活力 。 21213 纤维二糖酶活 以纤维二糖为底物 , 测定酶解 反应后葡萄糖生成量 , 表示酶活力 。由于葡萄糖和纤维 二糖都具有还原性 , 定糖方法难以区分 。常用人工合成 的糖苷化合物 , 如对硝基酚 2β2葡萄糖苷 ( PNPG) 、水 杨素为底物 , 测定生成的对硝基酚或葡萄糖 。 21214 滤纸酶活 1984 年国际理论和应用化学协会的 发酵委员会确定滤纸酶活法为标准方法 。滤纸为天然结 晶类纤维素 , 以其为底物经纤维素酶水解后生成的还原 糖量 , 表示纤维素酶系总的糖化能力 , 得到了广泛的应 用 。然而由于滤纸结构的不均一性 , 方法繁琐 , 导致测 定结果误差较大 , 难以精确定量 。 21215 差重法 以砂芯坩埚为酶解反应器 , 避免了水 解液转移过程中产生的偏差 , 同时也不必在酶解液中添 加反映终止剂 , 直接过滤洗涤使反应终止 。节约了试 剂 , 避免了试剂干扰 。测出的酶水解率比常规的以还原 糖量测出的酶水解率要高 。试验操作简便易行 , 重现性 好 , 适合于酶解样品较少的试验研究 [16 ] 。
在此基础上又发展了滤纸失重法 。即在最佳温度和 pH值条件下 , 让滤纸片和酶液反应一段较长的时间 (通常需要 2周以上 ) , 然后将滤纸片水洗烘干 , 测定滤 纸片反应前后的质量变化 , 计算出滤纸的失重率 , 从而 推算出酶活力 。 21113 羧甲基纤维素钠为底物的粘度减少和还原糖增 加的测定法 [9 ] 测定 CMC 粘度降低的方法分为旋转粘 度计法和工研法 。旋转粘度计法采用旋转粘度计 , 测定 底物 3 m in 和 18 m in 的粘度 , 利用公式推算出酶活力 。 工研法采用奥氏粘度计 , 测定底物粘度减至 1 /2 时所需 的时间 , 以 l0 m in使底物粘度降低 1 /2 的酶活作为 1 个 活力单位 。
D eterm ina tion M ethods of Cellula se Activ i ty
KANG J i2ting1 , WU Xiang2 , GAN B ing2cheng2 , ZHANG Xiao2p ing13 ( 11College of Resources & Environment, Sichuan Agricultural University, Yaπan 625014, China; 21M icrobiology Laboratory of Soil and Fertilizer Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610000, China)
还原糖增 加 法 是 通 过 底 物 与 酶 液 在 特 定 条 件 下 反 应 , 用葡萄糖含量的增加来计算酶活力 。目前普遍采用 该方法来测定纤维素酶的酶活 。 21114 分光光度计法 [10 ] 酶促反应中生成的糖类物质 与显色剂发生显色反应 , 用分光光度计在 500 nm 左右 的波长处测定吸光度 , 换算成还原糖量 , 计算出酶活 力 。分光光度计法大大缩短了酶活力测定所需要的时 间 , 而且有较高的精确度 , 是目前应用最广泛的方法 。 国内许多科研机构根据各自的实验目的 , 采用了不同的 底物和显色剂 , 因而由此衍生出的方法更加多样化 。 21115 快速测定纤维素酶 CMC液化活力法 [11 ] 以铬矾 为交联剂 , 使羧甲基纤维素交联产生粘度较大的凝胶 , 通过观测凝胶液化的程度和快慢确定酶活力的大小 。此 法简单方便 , 目测即可 , 用于菌种初筛十分方便 。 21116 平板法 在菌种选育工作中 , 都希望在平板上 对纤维素酶产生菌进行筛选 , 这样可以大大提高工作效 率 。磷酸膨胀纤维素易于制成均匀的双层平板 , 纤维素 酶在其上能够形成清晰的透明圈 , 此法广泛应用于产纤 维素酶的真菌选育中 。 21117 巴鲁阿 2斯温 (Barnch and swain) 测定法 以水 杨酸为底物 , 根据被水解出的水杨醇和 β2D 2葡萄糖量 , 用比色法测定 β2葡萄糖苷酶活力 。此法普遍应用于 β2 葡萄糖苷酶活力的测定 。 212 纤维素酶活力测定的主要方法
1 纤维素和纤维素酶
111富的碳水化合物 , 也是生物界最重要的碳 源之一 [1 ] 。纤维素分子是由许多吡喃型的 D2葡萄糖残 基以 1042β2葡萄糖苷键相联结而形成的多糖 , 是 1 种高 分子化合物 。