食品病原微生物快速检测技术及研究进展王 辉，张 伟，王 燕，顾 希（山东东营出入境检验检疫局， 山东东营 257091）摘 要：食品病原微生物传统检验方法费时、敏感度低、特异性差；随社会和食品工业快速发展，研究和建立食品病原微生物快速检测方法越来越受到世界各国重视。
该文介绍免疫学技术、分子生物学技术、代谢技术、仪器分析技术、生物传感器技术等检测微生物基本原理，及这些技术在食品病原微生物检测中研究进展。
关键词：病原微生物；食品检测；食品安全Research progress on rapid detection technology of pathogenicmicroorganism in foodsWANG Hui ，ZHANG Wei ，WANG Yan ，GU Xi（Dongying Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau ， Dongying 257091，Shandong ，China ）Abstract ：Co nventi o nal m et ho d are ti m e –co n sum ing ，l o w s en s itivity and h yp os en s itivity in f oo d pat ho geni c m i c r oo rgani sm dete c ti o n ，wit h t h e rapid devel o p m ent o f soc iety and f oo d pr o d uc ti o n in t h e w o rld ，s t u dy and t h e e s tabli shm ent o f f oo d pat ho geni c m i c r oo rgani sm rapid dete c ti o n te ch n o l o gy i s in c rea s ingly paid attenti o n t o by vari ous cou ntrie s. In t h i s arti c le ，t h e ba s i c prin c iple o f i mmu n o l o gy te ch n o l o gy ，mo le cu lar m i o l o gy te ch n o l o gy ，m etab o l o gy te ch n o l o gy ，in s tr um ental analy s i s te ch n o l o gy ，bi os en so rte te ch n o l o gy were intr o d uc ed ，and t h e pr o gre ss o f t h e s e dete c ti o n te ch n o l o gie s o n f oo d pat ho geni c m i c r oo rgani sm were reviewed .Key words ：pat ho geni c m i c r oo rgani sm ；f oo d dete c ti o n ；f oo d s afety 中图分类号：TS207.4文献标识码：A文章编号：1008―9578（2012）04―0001―05收稿日期：2012–03–06作者简介：王辉（1982~ ），男，工程师，硕士，研究方向：食品微生物快速检测。
随着世界经济全球化、贸易自由化和食品工业化迅速发展，食品安全已成为全球关注热点问题，而食品中病原微生物是影响食品安全最主要因素。
食品病原微生物传统检验方法步骤非常繁琐，需耗费大量人力、物力，且检测周期长、灵敏度较低，难以满足目前国内外对食品安全检测要求。
因此，研究和建立灵敏度更高、特异性更强、简便快捷食品病原微生物快速检测技术迫在眉睫。
本文对目前国内外改进和开发一些病原微生物快速检测技术及其在食品方面应用进行综述。
1 免疫学技术免疫学检测技术是应用免疫学理论而设计一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌细胞因子的实验方法，其基本原理是利用抗原、抗体间能发生特异性免疫反应以检测病原。
1.1 免疫荧光技术（IF T ）免疫荧光技术是将不影响抗原、抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应抗原（或抗体）结合后，形成免疫复合物在一定波长光激发下可产生荧光，借助荧光显微镜可检测或定位被检抗原。
目前免疫荧光技术可用于沙门氏菌、葡萄球菌毒素、E.Coli O157和单核细胞增生李斯特氏菌等快速检测。
张晓华等〔1〕利用副溶血弧菌免疫家兔制备多克隆血清，建立中国对虾病原菌―副溶血弧菌间接荧光抗体检测技术，不仅可用于诊断发病感染对虾，也可用于检测带菌状态或未发病感染对虾。
1.2 酶免疫技术酶免疫技术是利用抗原、抗体反应高度特异性和酶促反应高度敏感性，通过肉眼或显微镜观察及分光光度计测定，达到在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体部位，及对其进行定量目的。
根据抗原、抗体反应是否需要分离结合和游离酶标记物而分为均相和非均相两种类型。
非均相法较常用，包括液相与固相两种免疫测定法。
非均相酶固相免疫测定法即ELISA 在目前应用最为广泛。
Cryan 等〔2〕在研究大肠埃希氏杆菌（Escherichia coli.）内毒素时，将ELISA 法与DNA 探针技术等进行比较，发现ELISA 技术更灵敏、快速。
此外，ELISA 法还可用于食品介导病毒检测。
葛翠翠等〔3〕使用双抗夹心ELISA 检测食品中大肠杆菌O157∶H7，结果表明，该法稳定性、重复性良好，对纯培养菌液检出限为105 cfu/mL，具有良好敏感性及特异性。
杨静〔4〕等用沙门氏菌特异性单克隆抗体CB8和de7建立直接检测沙门氏菌方法，即用被检样品直接包被ELISA 板固定加酶标抗体作用一段时间后，加入底物显色后终止反应。
目前已成功应用于蛋品、鲜奶、肉制品中沙门氏菌检测，与传统方法相比，其敏感性和特异性均达到理想效果。
窦勇等〔5〕以副溶血弧菌1.2164作为抗原，免疫新西兰兔获得效价为1.6105多克隆抗体，以此多克隆抗体作为一抗，山羊抗兔IgG–HRP作为酶标二抗，建立副溶血弧菌间接ELISA快速检测法。
结果表明，此法在6 h内即可检测出浓度为104 cfu/mL副溶血弧菌，且与其它菌株均无交叉反应。
1.3 免疫印迹技术免疫印迹技术又称转移印迹技术，是以生物物理学方法（凝胶电泳高效分离）与特异性免疫反应（固相免疫测定）相结合而建立技术。
其借助高分辩率PAGE电泳将混合蛋白质样品有效分离成许多蛋白区带，分离后蛋白经电泳转移至固相支持物，通过与特异性抗体结合，即可定性或定量检测靶蛋白。
免疫印迹技术综合SDS–PAGE高分辨率及ELISA高敏感性和高特异性，是一种有效分析手段，目前应用于酵母和真菌检测。
1.4 免疫层析技术免疫层析技术将免疫学原理与层析原理相结合，借助毛细管作用，样品在条状纤维制成膜上泳动，其中待测物与膜上一定区域配体结合，通过酶促显色反应或直接使用着色标记物，在短时间内（20 min内）便可得到直观结果。
免疫层析按其原理可分为两类：一类以酶促反应显色为基础，以显色高度来定量；另一类则使用着色标记物，如乳胶颗粒、胶体硒、胶体金及脂质体等，层析时，标记物与待测物被相应配体捕获而浓集显色，以纤维膜上显色条有无或多少以定性或定量〔6〕。
目前在检验微生物时常用的是免疫胶体金技术。
罗立新等〔7〕选用柠檬酸钠改良法制备胶体金，测定其最适结合蛋白浓度为28 μg/mL，构建免疫层析检测试剂和检测方法，检测冷冻猪肉、牛奶、冰激凌及不同稀释度的产单核李斯特菌标准样品，灵敏度达87.5%，具有良好重现性。
1.5 免疫磁珠分离技术免疫磁珠分离技术是将免疫学反应高度特异性与磁珠特有磁响应性相结合一种新免疫学技术。
其基本原理是利用人工合成内含铁成分、可被磁铁磁力所吸引、外有功能基团、可结合活性蛋白质（抗体）磁珠，作为抗体载体。
当磁珠上抗体与相应微生物或特异性抗原物质结合后，则形成抗原―抗体―磁珠免疫复合物。
这种复合物具有较高磁响应性，在磁铁磁力作用下定向移动，使复合物与其它物质分离，从而达到分离、浓缩、纯化微生物或特异性抗原物质目的。
Skjerve等〔8〕用免疫磁珠分离技术从乳及乳制品、肉类和蔬菜中分离出沙门氏菌，其检测限为10个~20个/g细菌。
Tomoyasu〔9〕应用免疫磁性分离技术从引起中毒食物中成功分离出副溶血性弧菌。
张凡非等〔10〕采用免疫磁珠法分离海水海泥和蛤肉中副溶血性弧菌，将磁珠与副溶血性弧菌免疫血清混合，制备免疫磁珠，用于分离样品中细菌，分离出菌株接种平板并进行常规鉴定，结果此法较一般培养分离法极大提高检出率。
1.6 酶联荧光免疫分析技术酶联荧光免疫分析技术是在酶联免疫吸附分析基础上发展而成一种快速检测微生物方法。
其基本原理：首先将已知抗体吸附于固相载体，加入待测样本，样本中抗原与固相载体上抗体结合，然后酶标抗体再与样本中抗原结合；加入酶反应底物，底物被酶催化为带荧光产物，产物量与标本中受检物质量直接相关，然后根据荧光强度进行定性或定量分析。
陈思强等〔11〕评价自动酶联荧光免疫分析系统（VIDAS）检测冻肉中沙门氏菌灵敏度和特异性，使用VIDAS 法和常规细菌培养法平行检测各种冻肉样品中沙门氏菌，以常规细菌培养法作参照，对VIDAS技术进行评价。
结果在155份样品中，VIDAS法检出沙门氏菌阳性10例，阴性145例；常规细菌培养法检测出VIDAS法阳性样本中9例呈阳性，其余146例皆为阴性。
VIDAS法用于冻肉沙门氏菌检测灵敏度为100%、特异性为99%。
1.7 乳胶凝集试验乳胶凝集试验是利用抗原、抗体特异性结合特点，加上人工大分子乳胶颗粒标记抗体，使之与待测抗原发生肉眼可见凝集反应，以达到检测目标病原微生物或毒素目的。
此法可用于鉴定大肠杆菌O157∶H7等。
2 分子生物学技术2.1 基因探针技术基因探针技术又称核酸分子杂交技术，该技术于1968年由华盛顿卡内基学院Briuen等共同创建。
其原理是从微生物中提取或扩增特异性DNA片段，纯化后再将此DNA片段标记上可被检测指示剂，如放射性同位素、荧光物质等，使之成为特异性DNA探针。
微生物经处理后固定于另一固相表面上，经洗涤变性后加入DNA探针进行杂交，DNA探针可与同源性靶DNA进行互补性结合，依据指示剂选用合适方法进行检测〔12〕。
目前，国内外研究者已开发出多种基因探针用于食品微生物检测。
Kerdahi等〔13〕使用自动化酶连接的非放射性DNA探针，迅速准确检测出单核细胞增生李斯特菌。