酶的固定化技术及其应用曾鸿雁(西南科技大学,四川,绵阳)摘要:随着工业生物技术和酶工程的不断发展，酶在各个领域的广泛应用，对酶的要求也越来越严格。

本文针对目前酶工程技术之一酶的固定化，对酶的固定化技术及其展望做一综述。

关键词：酶，固定化，技术Immobilization of Enzyme And its Applications Abstract：with the continuous development of biotechnology industrial and enzyme engineering , enzyme are widely used in various fields and the requirements to enzymes also become more and more stringent . This article is to review the enzyme immobilization, which is one of the current enzyme engineering technologiesKey words: enzyme, immobilization, technology一、引言酶是一类具有生物催化性质的高分子物质，其催化性具有专一性强、催化效率高和作用脚尖温和等特点。

但是在实际工业生产中，由于实际环境因素，应用酶的过程出现了一些不足之处：①酶的催化效率不高。

人们在使用酶的过程中，往往要求酶的催化效率要足够高，以加快反应速度，提高劳动生产率，然而实际上很多酶的催化效率不够高而难于满足人们的使用要求。

②酶的稳定性较差。

大多数酶稳定性较差，在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素的影响下，都容易变形失活。

③酶的一次性使用。

酶一般是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系统中，与底物和产物混合在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用。

这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且也难于连续生产。

④产物的分离纯化比较困难。

酶反应后成为杂志与产物混在一起，无疑给产物的进一步分离纯化带来一定的困难。

为此，人们开始针对酶的这些不足寻求改善方法，方法之一就是酶的固定化。

固定化酶是20世纪60年代开始发展起来的一项新技术。

最初主要是将水溶性酶与不溶性载体结合起来，成为不溶于水的酶的衍生物，所以曾称为“水不溶酶”和“固相酶”。

但后来发现也可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中，高分子底物与酶在超滤膜一边，而反应产物可以透过膜逸出，在这种情况下，酶本身仍是可溶的。

因此，用水不溶酶和固相酶的名称就不恰当了。

在1971年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用“固定化酶”(immobilized enzyme)的名称。

所谓固定化酶是指固定在一定载体上并有一定的空间范围内进行催化反应的酶。

固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不足之处，具有提高酶的催化效率、增加稳定性、可反复或连续使用以及易于和反应物分开的显著优点。

二、酶的固定化技术采用各种方法，将酶固定在水不溶性的载体上，制备成固定化酶的过程成为酶的固定化（enzyme immobilization）。

酶的固定化方法很多，一般有吸附法、包埋法、结合法、交联法和热处理法。

1、吸附法吸附法是指利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上，而使酶固定化的一种方法。

吸附法又可以分为物理吸附法和离子交换吸附法二种。

物理吸附法指通过氢键、疏水作用和π电子亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上。

从而制成固定化酶。

其常用的载体有①有机载体。

纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等。

②无机载体。

氧化铅、藻土、白土、高岭土、多孔玻璃和二氧化钛等。

这种方法操作简单，反应条件温和，载体可反复使用，但结合不牢固，酶易脱落。

离子交换吸附法是将酶与含有离子交换基的水不溶载体相结合而达到固定化的一种方法。

常用的载体有①阴离子交换剂。

如二乙基氨基乙基-纤维素、混合胺类-纤维素、乙氨基乙基(TEAE)—纤维素、DEAE—葡聚糖凝胶、Amberlite IRA—93、410、900等。

②阳离子交换剂基。

如羧甲基(CM)—纤维素、纤维素柠檬酸盐、Amberlite CG50、IRC—50、IR—200、Dowex—50等。

离子交换吸附的酶吸附较牢，在工业上颇有广泛的用途。

吸附法的不足之处在于酶量的选择全凭经验，pH值、离子强度、温度、时间的选择对每一种酶和载体都不同，酶和载体之间结合力不强而导致催化活性的丧失和玷污反应产物等。

因此其应用受到限制，一般的科研人员都将此法于其他方法联用。

2、包埋法将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称包埋法。

包埋法又分为凝胶包埋法和微囊化法⋯。

凝胶包埋法是将个别酶分子包在高聚物格子中，可以将块状聚合形成的凝胶切成小块，也可以直接包埋在珠状聚合物中，后者可以使固定化酶机械强度提高10倍，并改进酶的脱落情况。

常用的凝胶有天然凝胶如琼脂凝胶和合成凝胶如聚丙烯酰胺凝胶等。

天然凝胶条件温和。

操作简便，对酶活性影响甚小，但强度较差；合成凝胶强度高，对问题、pH变化的耐受性强，但需要一定的条件下进行聚合反应，且此过程中酶往往部分变性。

微囊化法是将酶溶液或悬浮液包裹在膜内，膜既能使酶存在于类似细胞内的环境中，又阻止酶的脱落或直接与微囊外环境接触。

小分子底物则能迅速通过膜与酶作用，产物也能扩散出来。

因此，此法适用于底物和产物都是小分子物质的酶的固定化如天冬酰胺酶等。

另外，此法包埋的酶量很多，在医学上具有很大的应用可能性，因此越来越受到人们的注意。

3、结合法选择适宜的载体,使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。

根据酶与载体结合的化学键不同又可以把结合法分为离子键结合法和共价键结合法。

离子键结合法是通过离子键使酶与载体结合地固定化方法。

常用的载体是某些水不溶的离子交换剂，如DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。

离子键结合法进行酶固定化，条件温和，操作简单。

只需在一定的pH、温度和离子强度等条件下，将酶液与载体混合搅拌几个小时，或者将酶液缓慢地流过处理好的例子交换住就可以使酶结合在离子交换剂上，制备得到固定化酶。

此法制备的固定化酶，酶的催化效率损失较少，但离子键结合力较弱，酶与载体的结合不牢固，在pH和离子强度等条件改变时，酶容易脱落。

共价键结合法是酶蛋白的侧链基团和载休表面上的功能基团之间形成共价键而固定的方法。

其常用的载体有纤维素、琼脂糖凝胶、氨基酸共聚物等。

其优点是：酶与载体结合牢固，酶不易脱落，但反应条件较激烈，酶易失活，同时，制作手续亦较繁琐。

目前已建立的共价键结合法有①叠氮法。

将含有苯氨基的不溶性载体与亚硝基反应，生成重氮盐衍生物，使载体引进了活泼的重氮基团。

跌但集团可以酶分子中的酚基或咪唑基发生偶联反应制成固定化酶。

②叠氮法。

将含有酰肼基团的载体可用亚硝酸活化，生成叠氮化合物。

叠氮衍生物与酶分子中的氨基形成肽键，使酶固定化。

也可以与酶分子中的烃基、巯基等反应制成固定化酶。

③溴化氯法。

含有羟基的载体，如纤维素、琼脂糖凝胶等可以用溴化氯活化生成亚氨基碳酸衍生物。

亚氨基碳酸基团在微碱性的条件下可与酶分子上的氨基反应制成固定化酶。

④烷基化法。

含烃基的载体可用三氯-均三嗪等多卤代物进行活化生成含卤素基团的活化载体。

卤素基团可与酶分子上的氨基、巯基、烃基等发生烷基化反应制成固定化酶。

4、交联法使酶与带两个以上的多官能团试剂进行交联反应，生成不溶于水的二维交联聚集体，交联形成的固定化酶称为交联酶。

与共价结合法一样，都是靠化学结合的方法使酶固定化。

其区别在于交联法使用了交联剂。

常用的交联剂有戊二醛、鞣酸啪。

交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时间使用。

但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小，给使用带来不便。

为此，可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短。

5、热处理法热处理法是将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到固定化菌体的方法。

热处理只适用于那些稳定性较好的酶的固定化，在加热处理时，要严格控制好加热问题和时间，以免引起酶的变性失活。

热处理法也可以与交联法或其他固定化联合使用，进行双重固定化。

6、其他方法[1](1)物理方法。

将酶限制在半透膜或超滤膜中，使酶仍以天然状态(可溶的)长期连续使用。

用此方法固定的酶有蔗糖酶、酰胺酶等。

(2)利用可溶性一不溶性载体。

1989年，Masayuki等报道了肠溶衣聚合物(Enteric coating polmer )Eudragit L，当pH<4.0时，呈不可溶性(有利于酶的回收)，当pH>5.0时，呈可溶性(有利于酶接近不容性底物)。

三、固定化酶的特性将酶固定化制成固定化酶后，受到载体的影响，酶的特性发生了很大的变化。

主要体现在：1.稳定性固定化酶一般具有较好的耐热、耐酸碱、对蛋白酶抵抗增强、耐变性剂等稳定性2.最适温度固定化酶比原来的游离酶的最适催化温度有或高或低的变化，在工业应用中具有很大的应用价值3.最适pH据报道，最适pH的变化是由载体的静电荷决定的，用聚合阳离子作载体，其最适pH比固定化前向酸性一侧偏移1个pH单位。

这可解释为：当酶被结合到聚合阳离子载体上时，酶蛋白的阳离子数增多，从而造成固定化酶反应区域pH值比外部溶液偏碱。

这样，实际上酶的反应是在反应液的pH偏碱的一侧进行的，从而使最适pH值转移到了酸性一侧，若用聚合阴离子作载体，则与上述情况相反，最适pH值移向碱性一侧。

[2]4.底物特异性由于载体的空间位阻导致底物特异性的变化。

酶固定在载体上以后，大分子底物难于接近酶分子而使催化速度大大降低，而分子质量较小的底物受空间位阻影响较小或不受影响，与游离酶的作用无显著差别。

四、固定化酶的应用相比游离酶，固定化酶具有一系列其不能比的特性，固定化酶已经广泛应用于食品、轻工、医药、化工、分析、环保、能源和科学研究等各个领域。

1. 固定化酶在食品工业中的应用[3]1.1固定化酶在乳制品生产中的应用牛奶中含有一定量的乳糖,有些人体内缺乏乳糖酶,在饮用牛奶后常出现腹泻、腹胀等症状;另外,由于乳糖难溶于水,常在炼乳、冰淇淋中呈沙样结晶析出,影响风味。

乳糖酶可将乳糖分解为半乳糖和葡萄糖,如将牛奶用乳糖酶处理则可解决上述问题。

Fernandes等研究用琼脂糖作载体,固定来源于南极的冷适应菌Pseudoalterom onas sp的β- 半乳糖苷酶,并应用于牛奶中乳糖的降解,生产低乳糖牛奶;Caterina等运用固定化技术,研究牛奶中碱性磷酸酶的耐热性;Mona等研究用离子吸附法固定来源于B acillus licheniform is 5A1的牛奶凝结酶,并用于干酪生产。