与菌体生长不相伴随，以初级代谢的中间产物为原料而合成
抗生素、生物碱、毒素、色素、胞外多糖等
结构常较复杂对环境条件敏感
4、微生物转化发酵
利用微生物细胞的一种或几种酶，对外源化合物的
特定部位进行加工，如加入羟基、还原双键、脱氧
或切断支链等。 反应最显著的特点是特异性强，包括反应特异性、
结构位置特异性、立体特异性。 如： 甾体转化：环戊烷多氢菲核的化合物
创新霉素分子结构
真菌之根霉属(Rhizopus)
• 生产甾体激素、延胡索酸及酶制剂等。
真菌之曲霉属(Aspergillus)
• 生产枸橼酸、葡萄糖酸、有机酸类、抗生素，进 行甾体转化。
真菌之青霉属(Penicillum)
• 产黄青霉(Penicillum chrysogenum)
生产青霉素，也可用来生产葡萄糖氧化酶、葡萄 糖酸、柠檬酸和抗坏血酸
保藏期 1-6个月 1-2年
砂土管保藏法
1-10年
麸皮保藏法 甘油悬液保藏法
1年 1年/10年
冷冻真空干燥保藏法
用保护剂制备悬液，快 速冻结，减压抽真空， 需冻干机
各类微生物
5-15年
液氮超低温保藏法
保护剂，超低温（各类微生物 196℃），需超低温液氮 设备 与培养基混合直接低温 保存 专性活细胞寄生微生物（如 病毒）
原生质体融合
基因工程
从自然界中获得新菌种
土壤、空气、动植物等，严重污染的水域，极端
环境等 基本程序： • 采样预处理富集培养筛选鉴定野生型
菌株
诱变育种
物理或化学方法诱发突变
物理诱变剂：紫外线、X-射线、γ-射线等
化学诱变剂：氮芥、亚硝酸、5-氟尿嘧啶等
杂交育种：借助有性重组，使不同菌株的遗传
2、微生物酶发酵
各种酶制剂 糖化酶、α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等 天冬酰胺酶： 抗癌
纳豆激酶、链激酶： 治疗血栓
青霉素酰化酶：青霉素生产
需要诱导或遭受阻遏、抑制等调控作用，在菌种
选育、培养基配制以及发酵条件等方面需注意。
3、微生物代谢产物发酵
初级代谢产物： 与菌体生长相伴随的产物、对菌体生长、分化和繁殖是必须的 氨基酸、核苷酸、维生素、糖类等 菌体对其合成反馈控制严密，一般不过量积累 次级代谢产物：
发酵罐的类型
• 搅拌釜反应器 • 鼓泡式反应器 • 气升式反应器
发酵辅助设备
无菌空气系统
• 无菌空气的要求 灭菌系统、管道、阀门
培养基及其灭菌
培养基（medium）
培养基的成分 • 碳源、氮源、无机盐和微量元素、水、前体物、 促进剂、抑制剂
培养基的类型
按组成
按形态
按用途
合成培养基 （用于科学研究） 复合培养基 （用于工业生产）
方法名称 斜面低温保藏法 石蜡油封存法
主要特点 传代培养，4℃保藏 石蜡油隔绝空气，室温 或4℃保藏 沙土管作载体，干燥器 中抽真空，室温或4℃保 藏 麸皮作载体，干燥，4℃ 保藏 悬浮于10-15%甘油中， 需低温冰箱
适用范围 各种微生物的短期保藏。 各种微生物的中短期保藏， 不适用某些能分解烃类的菌 种。 产孢子微生物和芽孢细菌的 长期保藏，不适用对干燥敏 感的微生物 产孢子霉菌和某些放线菌， 工厂多采用此法 基因工程菌
物质得以交换
原生质体融合育种：借助原生质融合技术实现
遗传物质的交换
基因工程育种：DNA体外重组技术定向育种，
技术含量高，应用面广
三、制药微生物菌种的保藏 (Culture conservation)
目的：保证菌种经过较长时间后仍保持生活能力，
防止被杂菌污染，形态特征和生理形状尽可能不 发生变异。
固体培养基 液体培养基 半固体培养基
孢子培养基 种子培养基 发酵培养基
影响培养基质量的因素 • 原材料质量的影响 • 水质的影响 • 灭菌的影响 • pH的影响 • 其他影响因素
灭菌操作技术
• • • • • 工业生产中常用的灭菌方法： 化学物质灭菌 辐射灭菌 过滤介质除菌 热灭菌：包括干热灭菌和湿热灭菌
可的松（Cortisone）
学名：11-脱氢-17-羟皮质酮。由皮质醇分子C-11上 的羟基氧化为酮基而得的一种糖皮质素。给药后在 体内转变为皮质醇而发挥其强抗炎性。
四、微生物发酵药物的分类
生物来源 作用对象 作用机制 化学结构
细菌 真菌 放线菌
抗菌药 抗肿瘤药 抗病毒药 除草剂 酶抑制剂 免疫调节剂
15年以上
宿主保藏法
菌种保藏机构
• ＡＴＣＣ中国微生物菌种资源库 • ＣＣＣＣＭ中国微生物菌种保藏管理委员会 • ＮＣＴＣ国家标准菌库,全国典型菌种收集委 员会
四、微生物代谢产物的生物合成
（一）微生物合成的初级代谢产物 （二）微生物次级代谢产物的生物合成 基本特征： 1、次级代谢产物具有种特异性 2、分批发酵时，产生菌生长周期分为三个时期：菌 体生长期、产物合成期以及菌体自溶期 3、次级代谢产物不少是结构相似的混合物 4、次级代谢产物的合成受多基因控制
培养基和发酵设备的灭菌方法： 实罐灭菌（实消） 空罐灭菌（空消） 连续灭菌（连消） 过滤器及管道灭菌
无菌检查与染菌处理
无菌检查： 无菌试验、发酵液直接镜检和发酵液生化分析 染菌的判断：以无菌试验中的酚红肉汤培养基和 双碟培养的反应为主，以镜检为辅。 染菌防治技术： 污染杂菌 污染噬菌体
细菌之短杆菌属(Brevibacterium)
• 维生素B12、氨基酸、核苷酸类药物生产中常用的
菌种，也是酶法合成生产辅酶A的菌种。
细菌之棒状杆菌属(Corynebacterium)
• 生产氨基酸、核苷酸类药物，用于甾体转化
• 是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌，
• 如北京棒杆菌AS1.299钝齿棒杆菌AS1.542
生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代
谢产物的产量高，其它类似代谢产物少
操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离
稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯粹，遗传性状稳
定、不易变异退化
安全性：非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素
发酵菌种的选育方法
从自然界中获得新菌种 诱变育种 杂交育种
产链霉素
产金霉素 产红霉素 产土霉素
放线菌之诺卡氏菌属 (Norcadia)
• 生产利福霉素、蚊霉素等
放线菌之小单胞菌属 (Micromonospora)
• 多种可产抗生素，如棘孢小单胞菌(M. echinospora) 产庆大霉素。
放线菌之游动放线菌属 （Actinoplanes）
• 典型代表：济南游动放线菌 (Actinoplanes tsinanesisn) 产创新霉素(creatmycin；1964)
抑制细胞壁合成药
抗生素 影响细胞膜功能药 维生素 氨基酸 干扰蛋白质合成药 核苷酸 抑制核酸合成药 甾体激素 抑制生物能量反应药 酶及酶抑制剂
第二节 制药微生物 与产物的生物合成
一、常见的制药用微生物
• 细菌
• 放线菌 • 真菌
细菌之大肠杆菌属(Escherichia coli)
• 生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸等氨基酸类药物 • 基因工程的载体
细菌之芽孢杆菌属(Bacillus)
• 生产氨基酸、核苷酸、抗生素类、维生素B12、用 于甾体转化等。
细菌之假单胞菌属 (Pseudomonas)
• 生产维生素B12、氨基酸、核苷酸类； • 进行类固醇（甾体）转化； • 有些菌株可利用烃类生产单细胞蛋白。
细菌之乳酸杆菌属 (Lactobacillus)
• 20世纪40年代初，第二次世界大战爆发，青霉素 迅速工业大规摸生产。 • 深层培养、生产大规模化、多种抗生素、氨基酸、 核酸发酵成功。
第四阶段 • 20世纪50年代，利用代谢调控发酵氨基酸、核酸。 • 20世纪70年代，利用固定化酶或细胞连续发酵。 • 20世纪80年代，基因工程、蛋白质工程、细胞融合 技术等高新技术应用阶段。
• 生产抗癌类药物
放线菌
• 抗生素12000余种，60%左右来自放线菌，经济 价值大。
放线菌之链霉菌属 ( Streptomyces )
灰色链霉菌(Streptomyces griseus)
金霉素链霉菌(Streptomyces aureofaciens) 红霉素链霉菌(Streptomyces erythreus) 龟裂链霉菌 (Streptomyces rimosus)
第一阶段
• 1676年制成第一台显微镜 ——微生物的存在 • 1857年巴斯德证明了酒精是由活的酵母发酵引起 的 • 1897年毕希纳发现磨碎的酵母仍使糖发酵形成酒 精——酶
第二阶段
• 对发酵技术的认识起始于19世纪末，主要来自于
厌氧发酵，如利用酵母菌、乳酸菌生产酒精、乳
酸和各种发酵食品。
第三阶段
菌种保藏三要素
典型菌种的优良纯种的休眠体；
创造有利于种子休眠的环境（低温、干燥、缺氧、 避光、缺少营养）； 尽可能采用多种不同的手段保藏同一菌株。
菌种保藏的常用方法
斜面低温保藏法
石蜡油封存法
砂土管保藏法
麸皮保藏法
甘油悬液保藏法 冷冻真空干燥保藏法 液氮超低温保藏法 宿主保藏法
第二章 微生物发 酵制药技术
第一节 概述
一、微生物发酵制药的发展简史
自然发酵时期 纯培养技术时期 通气搅拌的好气性发酵工程技术时期 人工诱变育种与代谢控制发酵工程技术时期 发酵动力学和连续化、自动化发酵工程技术时期 微生物酶反应合成与化学合成相结合工程技术时 期
发酵工程的4个阶段
工程菌和新型微生物的开发
• 新型的生理活性多肽和蛋白质类药物：干扰素、
白介素促红细胞生成素等；