第八章发酵过程染菌及其防治张海龙山东教育学院生物系Shan Dong Institute of Education发酵染菌：指在发酵过程中生产菌以外的其他微生物侵入了发酵系统，从而使发酵过程失去真正意义上的纯种培养。

据报道，国外抗生素发酵染菌率为2％～5％，国内的青霉素发酵染菌率2％，链霉素、红霉素和四环素发酵染菌率5％，谷氨酸发酵噬菌体感染率1％～2％。

一、一、染菌对不同发酵过程的影响染菌对不同发酵过程的影响二、二、染菌发生的不同时间对发酵的影响染菌发生的不同时间对发酵的影响三、三、不同染菌途径对发酵的影响不同染菌途径对发酵的影响四、四、染菌对产物提取和产品质量的影响染菌对产物提取和产品质量的影响五、五、染菌对三废处理的影响染菌对三废处理的影响第一节第一节 染菌对发酵的影响染菌对发酵的影响一、染菌对不同发酵过程的影响•由于各种发酵过程所用的微生物菌种、培养基以及发酵的条件、产物的性质不同，染菌造成的危害程度也不同。

•不管是对于哪种发酵过程，一旦发生染菌，都会由于培养基中的营养成分被消耗或代谢产物被分解，严重影响到产物的生成，使发酵产品的产量大为降低。

例1)青霉素发酵过程：由于许多杂菌都能产生青霉素酶，因此不管染菌是发生在发酵前期、中期或后期，都会使青霉素迅速分解破坏，使目的产物得率降低，危害十分严重。

2)核苷或核苷酸发酵过程：由于所用的生产菌种是多种营养缺陷型微生物，其生长能力差，所需的培养基营养丰富，因此容易受到杂菌的污染，且染菌后，培养基中的营养成分迅速被消耗，严重抑制了生产菌的生长和代谢产物的生成。

3)柠檬酸等有机酸发酵过程：一般在产酸后发酵液的pH值比较低，杂菌生长十分困难，在发酵中、后期不太会发生染菌，主要是要预防发酵前期染菌。

4)谷氨酸发酵过程：周期短，生产菌繁殖快，培养基不太丰富，一般较少污染杂菌，但噬菌体污染对谷氨酸发酵的影响较大。

二、染菌发生的不同时间对发酵的影响•种子培养期染菌–菌体浓度低、培养基营养丰富•发酵前期染菌–杂菌与生产菌争夺营养成分，干扰生产菌的繁殖和产物的形成•发酵中期染菌–严重干扰生产菌的繁殖和产物的生成•发酵后期染菌–如杂菌量不大，可继续发酵。

如污染严重，可采取措施提前放罐不同染菌途径对发酵的影响三、不同染菌途径对发酵的影响三、•种子带菌：种子带菌可使发酵染菌具有延续性•空气带菌：空气带菌也使发酵染菌具有延续性，导致染菌范围扩大至所有发酵罐•培养基或设备灭菌不彻底：一般为孤立事件，不具有延续性•设备渗漏：这种途径造成染菌的危害性较大四、染菌对产物提取和产品质量的影响四、染菌对产物提取和产品质量的影响•1、对过滤的影响–发酵液的粘度加大；菌体大多自溶；由于发酵不彻底，基质的残留浓度加度。

造成过滤时间拉长，影响设备的周转使用，破坏生产平衡；大幅度降低过滤收率。

•2、对提取的影响–（1）有机溶剂萃取工艺：染菌的发酵液含有更多的水溶性蛋白质，易发生乳化，使水相和溶剂相难以分开–（2）离子交换工艺：杂菌易粘附在离子交换树脂表面或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换量•3、对产品质量的影响–（1）对内在质量的影响：染菌的发酵液含有较多的蛋白质和其它杂质。

对产品的纯度有较大影响。

–（2）对产品外观的影响：一些染菌的发酵液经处理过滤后得到澄清的发酵液，放置后会出现混浊，影响产品的外观。

五、染菌对三废处理的影响五、染菌对三废处理的影响•使过滤后的废菌体无法利用，发酵染菌的废液，生物需氧量（BOD）增高，增加三废治理费用和时间。

一、一、种子培养和发酵的异常现象种子培养和发酵的异常现象二、二、染菌的检查和判断染菌的检查和判断三、三、发酵染菌原因分析发酵染菌原因分析第二节第二节 发酵异常现象及原因分析发酵异常现象及原因分析•发酵过程中的种子培养和发酵的异常现象是指发酵过程中某些物理参数、化学参数或生物参数发生与原有规律不同的改变，这些改变必然影响发酵水平，使生产蒙受损失。

产蒙受损失。

对此应及时查明原因，加以解决对此应及时查明原因，加以解决。

一、种子培养和发酵的异常现象1、种子培养异常①菌体生长缓慢②菌丝结团③代谢不正常2、发酵异常①菌体生长差②pH值过高或过低③溶解氧水平异常④泡沫过多⑤菌体浓度过高或过低二、染菌的检查和判断•发酵过程是否染菌应以无菌试验的结果为依据进行判断。

•在发酵过程中，如何及早发现杂菌的污染并及时采取措施加以处理，是避免染菌造成严重经济损失的重要手段。

因此，生产上要求能准确、迅速的检查出杂菌的污染。

•目前常用于检查是否染菌的无菌试验方法主要有显微镜检查法、肉汤培养法、平板（双碟）培养法、发酵过程的异常观察法（如溶氧量）等。

•用革兰氏染色法（用革兰氏染色法（Grams stain Grams stain Grams stain）对样品进行涂片、染）对样品进行涂片、染色，然后在显微镜下观察微生物的形态特征，根据生产菌与杂菌的特征进行区别、判断是否染菌。

•如发现有与生产菌形态特征不一样的其它微生物的存在，就可判断为发生了染菌。

•此法检查杂菌最简单、最直接、最常用。

必要时还可进行芽胞染色或鞭毛染色。

1、显微镜检查法（镜检法）2、肉汤培养法•通常用葡萄糖酚红肉汤作为培养基，将待测样品直接接入经完全灭菌后的肉汤培养基中，分别于3737℃℃、2727℃℃进行培养，随时观察微生物的生长情况，并取样进行镜检，判断是否有杂菌。

•肉汤培养法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌，同时此法也可用于噬菌体的检查。

葡萄糖酚红肉汤0.3％牛肉膏、0.5％葡萄糖、0.5％NaCl、0.8％蛋白胨、0.4％酚红溶液，pH 7.2•将待测样品在无菌平板上划线，分别于3737℃℃、2727℃℃进行培养，一般养，一般24h 24h 24h后即可进行镜检观察，检查是否有杂菌。

有后即可进行镜检观察，检查是否有杂菌。

有时为了提高平板培养法的灵敏度，也可将需要检查的样品先置于先置于373737℃℃培养培养6h 6h 6h，使杂菌迅速增殖后再划线培养。

，使杂菌迅速增殖后再划线培养。

3、平板划线培养或斜面培养检查法注意①无菌试验时，如果肉汤连续三次发生变色反应（红色→）或产生混浊，或平板培养连续三次发现有异常菌黄色黄色）或产生混浊，或平板培养连续三次发现有异常菌落的出现，即可判断为染菌。

②有时肉汤培养的阳性反应不够明显，而发酵样品的各项参数确有可疑染菌，并经镜检等其它方法确认连续三次样品有相同类型的异常菌存在，也应该判断为染菌。

③一般来讲，无菌试验的肉汤或培养平板应保存并观察至本批（罐）放罐后12h，确认为无杂菌后才能弃去。

④无菌试验期间应每6h观察一次无菌试验样品，以便能及早发现染菌。

三、发酵染菌原因分析•发酵染菌后，一定要找出染菌的原因，以总结防治发酵染菌的经验教训，积极采取必要措施，把杂菌消灭在发生之前。

如果对已发生的染菌不作具体分析，不了解染菌原因，未采取相应的措施来防治染菌，将会对生产造成严重的后果。

•造成发酵染菌的原因很多，且因工厂不同而有所不同，但设备渗漏、空气净化达不到要求、种子带菌、培养基灭菌不彻底和技术管理不善等造成各厂污染杂菌的普遍原因。

35.13环境污染及原因不明11.34管理和操作不当 1.72种子带菌15.46设备问题4.30补料、取样带菌32.05空气系统染菌染菌百分率/％染菌原因染菌百分率/％染菌原因表：上海天厨味精厂谷氨酸发酵染菌分析5.890.391.451.5410.1310.1524.91蛇管穿孔 接种管穿孔 阀门泄漏 罐盖漏 其他设备漏 操作问题 原因不明9.640.190.7919.962.090.4812.36种子带菌接种时罐压跌零 培养基灭菌不透 空气系统带菌 搅拌轴密封泄漏 泡沫冒顶 夹套穿孔百分率（%）染菌原因百分率（%）染菌原因表：国外一抗生素发酵染菌原因的分析8.207.6026.001.6011.000.607.091.600.6035.00外界带入杂菌（取样、补料带入）设备穿孔空气系统带菌停电罐压跌零接种蒸汽压力不够或蒸汽量不足管理问题操作违反规程种子带菌原因不明百分率（%）染菌原因表：国内一制药厂发酵染菌原因的分析•对于每一个发酵过程而言，污染的杂菌种类的影响是不同的。

噬菌体谷氨酸青霉柠檬酸危害小的杂菌危害大的杂菌发酵产品双球菌、芽胞杆菌、荚膜杆菌四环素粗大杆菌细短杆菌、假单胞菌、产气杆菌链霉素粗大杆菌细短产气杆菌青霉素1、染菌的杂菌种类分析设备或冷却盘管渗漏、无菌室灭菌不彻底、无菌操作不当、糖液灭菌不彻底（糖液放置时间较长）等真菌种子带菌、空气过滤效率低、除菌不彻底、设备渗漏、操作问题等球菌、无芽胞杆菌等培养基或设备灭菌不彻底、设备存在死角等耐热的芽胞杆菌原因杂菌2、发酵染菌的规模分析①大批量发酵罐染菌②部分发酵罐染菌③个别发酵罐连续染菌（如果采用间歇灭菌工艺，一般不会发生）连续染菌如杂菌类型相同，一般是空气净化系统存在空气系统结构不合理、空气过滤介质失效等问题发生在发生在发酵中、后发酵中、后期种子带菌、连消设备染菌发生在发生在发酵前期发酵前期原因染菌时期原因染菌时期中间补料染菌，如补料液带菌、补料管渗漏发酵后期种子带菌、连消系统灭菌不彻底发酵前期大都由于设备渗漏造成，应仔细检查阀门、罐体或罐器是否清洁等。

一般设备渗漏引起的染菌，会出现每批染菌时间向前推移地现象。

3、不同污染时间分析•染菌发生在种子培养阶段，或称种子培养期染菌。

通常是由种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底，以及接种操作不当或设备因素等原因而引起染菌。

•在发酵过程的初始阶段发生染菌，或称发酵前期染菌。

大部分也是由于种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底，以及接种操作不当或设备因素、无菌空气等原因而引起。

•发酵后期染菌大部分是由空气过滤不彻底、中间补料染菌、设备渗漏、泡沫顶盖以及操作问题而引起。

高度重视•认为染菌是不可避免的，这是一种错误看法。

认为染菌是不可避免的，这是一种错误看法。

““决定的因素是人不是物””。

只要我们思想上重视，对定的因素是人不是物各个因素和环节周密考虑、严格掌握，是完全可以避免和减少污染的。

•引起染菌的原因很多。

引起染菌的原因很多。

““世界上的事情是复杂的，是由各方面的因素决定的。

是由各方面的因素决定的。

””我们不能机械地认为某种染菌现象必然是从某一途径引起的，应该把染菌的位置、时间和杂菌的类型等各种现象加以综合分析，才能正确判断从而采取相应的对策和措施。

一、一、种子带菌及其防治种子带菌及其防治二、二、空气带菌及其防治空气带菌及其防治三、三、操作失误导致染菌及其防治操作失误导致染菌及其防治四、四、设备渗漏或设备渗漏或“死角”造成的染菌及其防治五、噬菌体污染及其防治第三节第三节 杂菌污染杂菌污染杂菌污染的途径和防治的途径和防治•原因•措施一、种子带菌及其防治保藏斜面试管菌种染菌、培养基和器具灭菌不彻底、种子转移和接种过程染菌、种子培养所涉及的设备和装置染菌。