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实验试剂和器材
1.材料： 低分子量标准蛋白试剂盒:
低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200 兔肌动蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 根据说明书处理标准蛋白 样品：称3mg样品，加2 ml蒸馏水溶解。
标准蛋白质样品
• 标准蛋白质样品：是一组（5～7种）
已知的合适的分子量范围的、构形 相近的一套蛋白质，溶解在样品缓 冲液中备用。 样品的浓度 • 分析目的、检测方法和样品的组成 是关键； 未知样品浓度：0.1～20mg/ml 考玛斯亮篮染色：1～2mg/ml 银 染 色 :0.02～0.2mg/ml 高纯度样品： 0.5～2mg/ml 加样 电泳
2.实验试剂
(1) 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺 （Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中， 4℃贮存可用1-2月。 （2）10%SDS（十二烷基硫酸钠） （3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl分离胶缓冲液：称取 Tris18.2g加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.9， 最 后用蒸馏水定容至100ml。 （4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl浓缩胶缓冲液：称取 Tris12.1g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8， 最后用蒸馏水定容至100ml。 （5）0.05mol/LpH6.8Tris-HCl样品溶解缓冲液：称取 Tris0.6g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8，最 后用蒸馏水容至100ml。
2.实验试剂
（7）10%过硫酸铵(AP) （8）TEMED（四甲基乙二胺） （9）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝（2mg）+甘油（2g） +0.05mol/L pH8.3TrisHCl（2ml），最后定容至10ml。 （10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。 （11）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液 250ml， 过滤后备用。 （12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至 1000ml。 （13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘 氨酸28.8g， 加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。
③电荷效应
蛋白质所带的净电的性 质和电荷量与分子的迁 移率的关系，在同一电 场强度中，在单位时间 内各分子迁移的距离的 差别而到达分离。
操作
PH8.3 PH6.7 PH8.9 PH8.3
1. 垂直柱状，板状的不 2. 3. 4. 5. 6. 7.
连续凝胶电泳系统的 组成和配制； 均一凝胶与梯度凝胶 配制； 电极缓冲液系统； 样品的准备； 加样要求 电泳 检测
不连续凝胶电泳（disc）的分离原理
(一).原理 • 不连续凝胶电泳系统具有与一般电泳的① 电荷效应分离 外，还具有②浓缩效应与③分子筛效应，因而，能提高 电泳的分辨率；使电荷性质与密度相近的但分子量有差 别的分子得以分离；或分子量相近、性质一样、电荷性 质与密度有差别的分子可以分离；或电荷性质、分子量 大小相近，但构型不同时亦可分离。 碱性不连续－分离酸性样品 • 不连续凝胶电泳洗脱 酸性不连续－分离碱性样品
T=
a+b
m C=
X100% b x100
a+b
C=6.5-0.3T 稀溶液
浓溶液－ －交联剂
聚丙烯酰胺凝胶的三维网状结构
凝胶－ －结点
T
ab m
100(％
C
b ab
1001 ％
凝胶浓度的计算
• 聚合后的聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔
径大小均取决于两个重要参数T和C，T是丙烯酰胺和甲叉双 丙烯酰胺两个单体的总百分浓度。C是与T有关的交联百分 浓度。T与C的计算公式是：
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE） 测定蛋白质分子量
实验目的
• 学习PAGE分离蛋白质的原理 • 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量
的原理。 • 掌握垂直板电泳的操作方法。 • 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量 及染色鉴定。
一. PAGE分离蛋白质的原理
• PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统
大多数蛋白质分子呈酸性或中性，适合用碱性系统进行 电泳分离。
①.浓缩效应
1.凝胶的组成：浓缩胶为大孔径
（稀） T＜5％，分离胶一般为小 孔径（浓）T﹥7.5％。样品在较稀 的凝胶上自由迁移，直至浓凝胶时， 便形成一道栅栏，所有的样品分子 在浓缩胶的界面堆积成一窄带，得 到浓缩，然后，再依据分子量的大 小进行电泳分离。 2.缓冲液的组成:图示。PH系统的 不连续，各种分子的电荷之间的差 异进行分离。 3.缓冲ห้องสมุดไป่ตู้系的不连续，其中各组成 的离子、快慢离子迁移快慢的差别 是影响样品浓缩效应的重要因素。 4.离子的迁移速率及浓度的不连续 又造成电场强度与电导率的变化。
实验原理
• 1)
SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，特别 是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。影 响它们结合的因素主要有三个： 溶液中SDS单体的浓度，当单体浓度大于 1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比 为1:1.4，如果单休浓度降到0.5 mmol/L以下 时，两者的结合比仅为1: 0.4这样就不能消除蛋 白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDS的充 分结合，它们的重量比应该为1:4或1:3 样品缓冲液的离子强度。SDS电泳的样品缓冲液 离子强度较低，通常是10～100mmol/L 二硫键是否完全被还原
垂直柱状，板状的 不连续凝胶电泳系 统的组成和配制
缓冲液系统
• 浓缩凝胶缓冲液
0.5mol/L Tris-HCl,PH6.8 • 分离凝胶缓冲液 1.5mol/L Tris-HCl,PH8.8 电极缓冲液系统 0.025mol/L Tris（三羟甲基氨基甲烷） 0.2mol/Gly (甘氨酸) PH8.3 • 样品缓冲液 0.1mol/L Tris-HCl,PH 6.8, 40%甘油、0.05mg/ml溴 酚蓝 • 样品缓冲液的要求： 选择合适的PH与离子强度，以保证样品的溶解性、稳定性、 生物活性。并加入便于观察电泳前沿的指示剂。
光照
还原型
O2
游离基
聚合反应
聚丙烯酰胺凝胶的孔径和分子筛效应
• 凝胶是具有高粘度、高摩擦阻力的支持介质，能起到防止对流，把扩
散减到最小，而且能影响大分子颗粒的移动过程。 响．
• 大分子在凝胶中的分离是受其所带的电荷、尺寸、和形状因素的影 • 凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸筛分能力
• SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中
实验原理
引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS能断裂分子内和分 子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使 半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强 还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负 电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的 SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分 子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白 质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是 按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移 速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时， 蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式： logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b 均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子 量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条 件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求 得分子量。
ab b 100(％ C 100 （％） T ） a＋b m
• 上式中a为丙烯酰胺的克数，b为甲叉双丙烯酰胺的克数，
m为水或缓冲液体积（ml）。式中a与b的比例很重要。富
有弹性，且完全透明的凝胶，a与b的重量比应在30左右。
聚丙烯酰胺的聚合及影响因素
① 化学聚合：以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲级乙二胺 （TEMED）为加速剂，使丙稀酰胺、甲基双丙稀酰胺发生连 锁反应形成网状的聚合物。 • 丙稀酰胺由过硫酸铵（AP）在碱性条件下产生游离氧自 由基引发单体丙稀酰胺成为自由基状态而成的。在碱性 PH 时，反应速率迅速；而在酸性条件时，同样浓度溶液，聚 合速率减慢。 • 在低温时聚合，凝胶会变得脆而浑浊，且重复性差，在 25 ℃聚合的凝胶则较透明和有弹性。 • 分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合，O2使过硫酸铵（AP） 分解。故在做胶后常要用水进行封闭； • 金属离子也干扰凝胶的化学聚合。
光吸收 检测 考玛斯亮篮染色
染色
银 染 色
二、 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
（SDS-PAGE） 测定蛋白质的分子量
SDS-PAGE，主要用于测定蛋白质亚基 的分子量。与其它方法相比，它不需 要昂贵的仪器设备，操作简便，能在 较短的时间内得到结果，有较高的重 复性。且不需要非常纯的样品，因此 是目前用于测定蛋白质亚基的分子量 的一种最好的方法。
②分子筛效应
• 移动界面到达浓缩胶和分
离胶界面时，凝胶的PH变 化明显，缓冲液中甘氨酸 的觧离迅速增加，直至完 全觧离出 gly-,其分子量 小，迁移超过蛋白质分子。 而丧失夹击的作用；同时， 凝胶的孔径变小，降低了 蛋白质的迁移率。故蛋白 质分子在均一的电压梯度 和PH 值中泳动，依其分 子量的大小而分开。
2)
3)
实验原理
• 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量时，只有完全
打开二硫键， 蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到 亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系。因此在用 SDS处理样品同时往往用巯基乙醇处理，巯基乙醇是一种强还 原剂，它使被还原的二硫键不易再氧化，从而使很多不溶性蛋 白质溶解而与SDS定量结合。 有许多蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如胰 凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇作用下，解离成 亚基或单条肽链，因此这一类蛋白质，测定时只是它们的亚基 或单条肽链的MW。 已发现有些蛋白质不能用SDS-PAGE测定分子量。如电荷异常 或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（某些糖蛋白） 以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。 一般至少采用两种方法测定未知样品的分子量，互相验证。