基因打靶技术【摘要】基因打靶技术是建立在同源重组技术之上,可对基因组进行定位修饰的实验方法。

本文简述了基因敲除技术的基本原理、打靶策略、筛选机制,在动植物和微生物中常用的基因敲除方法以及基因打靶的应用。

基因敲除技术是研究功能基因作用的重要方法, 是后基因组时代的重要研究内容。

【关键词】基因打靶;同源重组;打靶策略;筛选机制一．前言发展历史：基因敲除（gene knockout）又称基因打靶（Gene targeting）是自20 世纪80 年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，。

早在80年代初,人们就开始研究在哺乳动物基因组中,存在使外源DNA与现存同源序列同源重组的可能性。

1985年, Smithies及其同事的研究使之得到确证。

同期的相关研究证明了鼠多能干细胞系具有诱发小鼠产生种系组织的能力,甚至在长期培养后仍存在,导入这些细胞器系的突变可以传给后代。

其传统概念是指同源重组敲除技术即利用DNA 转化技术，将构建的打靶载体导入靶细胞后，通过载体DNA 序列与靶细胞内染色体上同源DNA 序列间的重组，将载体DNA 定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，或与靶细胞基因组上某一确定片段置换，从而达到基因敲除的目的[5]。

随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和RNAi，它们同样可以达到基因敲除的目的。

所以，基因敲除的基本原理是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的一种分子生物学技术。

二．主题1基因打靶的基本原理绝大多数的基因打靶策略都是基于同源重组( homologous recombination)的机制。

同源重组是指发生在非姐妹染色单体( sister chromatin)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合,普遍存在于噬菌体、细菌和真核生物中。

基因敲除的操作步骤基因敲除的一般流程见图1, 基本程序是: 用PCR 技术扩增目的基因序列, 在体外插入卡拉霉素、四环素等受体菌原先不具有的抗性标记, 使目的基因失活,再将失活的目的基因构建至一环状载体上, 用电转化、显微注射等方法将构建好的载体转化入受体细胞内, 以抗性标记初步筛选阳性菌或进行目的基因功能的失活检测, 再以PCR, southern杂交等做进一步验证。

现在, 为了更好地区别单交换与双交换造成的重组, 通常使用两个抗性标记,在发生单交换时, 阴性和阳性抗性标记都会整合至基因组, 而发生双交换时,第二次同源重组会导致基因回复至野生型或敲除目的基因, 在前一种情况下,两种标记都不存在; 在后一种情况下, 基因组上只有阳性标记, 因此这样的敲除子可以通过正负筛选鉴别出。

但如果载体构建时在同源序列内部引入一些突变, 就不会回复至野生型, 这样, 既能实现基因的失活, 基因组上又不会带有抗性标记, 这对构建/食品级0的安全菌株是有益的。

几种常用的基因敲除技术1 利用同源重组进行基因敲除基因敲除是在同源重组技术及胚胎干细胞( embryonic stem cell, ES细胞)技术的基础上逐步完善发展起来,主要是利用DNA转化技术,将含有目的基因和靶基因同源片段的重组载体导入靶细胞,通过载体与靶细胞染色体上同源序列间的重组,将外源基因整合入内源基因组内,使外源基因得以表达。

通过研究靶细胞或者个体在目的基因插入前后遗传特性的改变,达到研究基因功能的目的[ 1 ] 。

基因敲除技术已从最初简单的完全敲除发展到条件敲除阶段,现正朝着特定组织基因敲除、特定时间基因敲除的可调控敲除方向发展。

完全基因敲除是通过同源重组直接将靶基因在细胞或者动物个体中的活性完全消除;而条件基因敲除则是将某个基因的修饰限制于特定类型的细胞或个体发育特定的阶段,即通过位点特异的重组系统实现特定基因敲除[ 2 ] ,现阶段以噬菌体的Cre /Loxp系统和酿酒质粒的FLP /FRT系统应用得最为广泛[ 3 ] 。

2 利用随机插入突变进行基因敲除基因定点敲除虽然是最直接的研究基因功能的方法,但是对开花植物而言,缺乏高效实用的定点突变技术。

目前较为有效的方法是大规模的随机插入突变,它为在基因组范围内敲除掉任何一个基因提供了可能。

这项技术具有效率高、基因完全失活、容易分离鉴定被插入引起失活的目的基因等优点。

随机插入突变可以分为T - DNA插入突变和转座子插入突变。

以农杆菌介导的T - DNA插入突变适用于多种植物,可以直接在植物基因组DNA中产生稳定的插入突变,而且插入位点的随机性较强,但是它只适用于那些容易被T - DNA转化的植物,且常常会引起的染色体重排现象,使突变体表型与T - DNA插入无关而难以进行遗传学分析。

尽管如此,近年来将T - DNA插入突变应用于拟南芥还是获得了广泛的成功。

[ 4 ]转座子插入突变是利用了转座子在染色体上可移动的特点,当它跳跃插入到某个功能基因时,就会引起该基因的失活,并诱导产生突变型。

因此可以利用某些能随机插入基因序列的转座子,在目标细胞基因组中进行随机插入突变,建立一个携带随机插入突变的细胞库,然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。

目前研究报道,能用于任何物种的转座子打靶载体是以两种噬菌体Mu为基础的mini -Mu转座子(每个转座子上都携带标记基因) ,它们可以在拟删除基因两侧各插入一个mini -Mu转座子,然后在两个插入位点之间的制造缺失。

这种缺失可以使两个转座子加上靶区之间的部分基因转移,留下一个带有选择标记在两侧的与靶基因同源的臂。

利用mini - Mu转座子进行基因敲除具有极大的方便性,它不需要知道基因组序列,仅已知外显子即可,且载体构建迅速,技术简单,载体可以携带多种不同抗性基因,可以同时处理多基因。

但是转座子的应用也有一定限制,比如要求转座子本身较短,容易操作,且对任何拟敲除区域有较高转座效率等[ 5 ] 。

3 RNA干扰引起的基因敲除现在普遍认为转录后基因沉默是生物保持基因的完整性,抵御外来核酸入侵,抑制转座因子诱导DNA突变的手段,广泛存在于真菌、植物、线虫、脊椎动物和大肠杆菌中[ 6 ] 。

RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种普遍的转录后基因沉默的机制,由siRNA ( small intereferenceRNA)引起, siRNA是外源基因产生的dsRNA在Dicer酶的作用下所产生的长度为21 - 22nt的一系列片段的总称,具有很强的关闭基因的功能,能够介导RNA干涉现象,诱导出一种由siR2NA分子、核酸酶以及螺旋酶等结合在一起的RNA诱导沉默复合物(RNA - induced silencing comp lex, R ISC) 。

R ISC能够解开siRNA并精确的指导特异的mRNA降解,使细胞抵抗外来基因侵入及病毒感染。

因此,通过将dsRNA分子导入细胞内,特异性地降解细胞内与其同源的mRNA,封闭内源性基因的表达来失活该基因同样可以实现基因的敲除。

1998年, RNAi技术首先在线虫中建立,目前已在线虫、果蝇、真菌及拟南芥等生物中分别建立,并用于研究特定基因或已知基因在特定发育时期的功能[ 7 ] 。

RNAi的作用特点有: (1)特异性强,针对同源基因共有序列的RNAi 则只能导致同源基因失活,不影响其他内源性mRNA 的表达; (2)效率高,少量的dsRNA分子就可以完全抑制相应基因的表达,能在低于反义核酸几个数量级的浓度下研究目的基因; (3)穿透性强, RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限,在不同细胞间长距离传递和维持[ 8 ] 。

RNAi技术操作相对简便,结果快捷,尤其对于那些不容易获得突变体的基因或生物体来说, RNAi技术无疑提供了一种快速有效的研究基因功能的方法。

由于dsRNA引入生物体内的剂量和时间可以人为控制, RNAi技术可以用于研究某个特定基因在特定发育阶段的功能。

伴随着功能基因组学研究的深入, RNAi技术在研究信号传导途径、胚胎发育相关因子以及参与基本生物反应过程的新基因功能方面有巨大发展潜力,它将带来生物学研究的革命。

虽然RNAi技术有如此明显的专一性优点,但RNAi不能作用于所有基因和某些细胞类型(如神经元) ,很多设计的dsRNA不能产生抑制靶基因转录后沉默的效果。

由于RNAi实际上只是在转录后水平上降低基因的表达,并不象基因敲除那样完全把基因从基因组中剔除掉,有时也会因背景的不干净导致产生的表型难以分析[ 9 ]。

因此, RNAi不能完全取代传统的基因敲除技术。

基因敲除的应用基因敲除的威力在于研究者可以选择性地修饰基因及选择如何去修饰,最终完全控制该段基因的DNA序列或修饰其周围的调控元件。

由于几乎所有生命现象均由基因控制或受其影响,因此打靶技术在几乎所有生物学领域如微生物学、动物学、植物学、医学等领域都有应用价值。

它目前已经广泛的应用于各个方面,并取得了较大的进展。

基因敲除在医疗领域的应用基因敲除可用于建立人类疾病的转基因动物模型,为医学研究提供材料。

从敲除技术诞生之日直到现在,研究较多的是用小鼠ES细胞进行基因打靶, 所建立的小鼠模型多与人类遗传性疾病有关[ 14 ] 。

已产生的模型包括与癌基因和肿瘤抑制基因、免疫相关基因、生长因子与受体基因等。

这些模型的建立为治疗人类疾病提供了很大帮助。

如1989年囊性纤维化病(CF)的致病基因(CFTR)被成功地克隆, 1992年成功建立了CFTR基因敲除的CF小鼠模型,为CF基因治疗提供了很好的动物模型,得以顺利通过了基因治疗的动物试验,于1993年开始临床试验并获得成功。

基因敲除用于异种器官移植。

异种器官移植是将动物的器官、组织或者是细胞导入人体体内,排斥反应是限制这一新兴技术发展的主要瓶颈。

位于猪细胞膜表面的末端α - 1, 3 - 半乳糖苷转移酶抗原决定簇是引起排斥反应的重要原因,通过α - 1, 3 -半乳糖苷转移酶的基因敲除,为家猪可成为人体器官的有效供体提供了可能[ 15 ] 。

除以上外,基因敲除还可用于治疗遗传病等,包括去除多余基因或修饰改造原有异常基因以达到治疗目的。

基因敲除用于改造动植物基因,鉴定新基因和其新功能,研究发育生物学深入研究基因敲除生物的发育及生命各期的表现,可以得到详细的有关该基因在生长发育中的作用,为研究基因的功能和生物效应提供模式。

例如,目前人类基因组研究多由新基因序列的筛选检测入手,进而用基因敲除法在各类生物体上观察该基因缺失引起的表型变化。

目前已报道了多种学习、记忆以及LTP、LTD有缺陷的基因敲除动物,发现多种基因在学习、记忆的形成过程中必不可少。

动植物育种对动植物的基因进行修饰改造,可产生一些人类需要培育的生物新品种。