S (DNA synthesis)
G2
细 胞 周 期（cell cycle）
G1期(DNA合成前期) 从有丝分裂到DNA复制前的一段时期，此期 主要合成RNA和核糖体。
S 期(DNA合成期) 除了合成DNA外，同时还要合成组蛋白。DNA复 制所需要的酶都在这一时期合成。
G2期(DNA合成后期) 大量合成RNA及蛋白质，包括微管蛋白和促成 熟因子等。
加入500ulPBS（含50ug/ml溴化乙锭（PI）， 100ug/mlRNase A,0.2% Triton X-100)40C避光孵育 30分钟。 流式细胞仪检测：一般细胞计数2-3万个。结果用软 件Modfit分析。
Modfit LT 分 析 细 胞 周 期
细胞周期结果分析
CV值：又称为变异系数，一般CV值越小 ，峰型越好，越尖锐。能控制在5%左右 是比较好的结果，一般小于10%就可以认 可了。
七、流 式 细 胞 仪 的 科 研 应 用
树突细胞研究 干细胞研究 癌症病人的多药耐药性 细胞动力学功能研究 环境微生物分析 流式细胞术与分子生物学研究 流式细胞术在免疫检验中的应用
FCM 在 细 胞 生 物 学 中 的 应 用
DNA 细 胞 周 期 分 析
G1
M (mitosis)
M期（细胞分裂期）由一个母细胞分裂成为两个子细胞 。 G0期（细胞休眠期）暂时离开细胞周期，停止细胞分裂，去执行
一定生物学功能的细胞所处的时期 。
PI染色检测细胞周期 Protocol
离心收集细胞，弃上清，用PBS洗细胞两次。 加入预冷的70%乙醇，于40C固定过夜，或-200C长期
固定。 细胞染色：离心收集细胞，用1mlPBS洗细胞一次，
G2/G1为1.82.（即G2期是四倍体细胞， 而G1期是二倍体细胞，比值应为1.8-2.0 之间。若小于1.8，则细胞染色不充分。
Peng zhang; Free Radical Research,2009,43(3):224-233.
细胞凋亡的检测
细胞形态及细胞膜通透性的变化(Hoechest
细胞相对数 量
单参数直方图
信道 (channel )
2.双 参 数 直 方 图
双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量 细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可 以确定细胞在图上的表达位置。
双参数信号通常采用对数信号，最常用的是 点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点 图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度 的颗粒数量的多少。
（2）光 学 系 统
由激光光源、分色反光镜、光束成
形器、透镜组、滤片和光电倍增管组成
。
Flow Tip
SS and FL Detector
FS Detector
Laser
（3）数 据 处 理 系 统
主要由计算机和及其软件（BD
FASCDiva和BD ModFit LTTM）组成。
流式细胞仪与显微镜的区别
2. 区阈（Region设置）:
如十字门分析时，由四个 区阈构成，即 G=D1+D2+D3+D4。
D1：CD4+/CD3D2：CD4+/CD3+ D3：CD4- /CD3D4：CD4- /CD3+
六、流式细胞仪免疫分析的技术要求
样本制备 标记染色 质量控制
（一）免 疫 样 品 的 制 备 单细胞悬液
区别
流式细胞仪
光学显微镜
光源 对象 承载工具 检测信号 放大方式 统计 结果
激光 细胞、生物粒子
鞘液及流动室 光学信号
PMT、放大电路 计算机
多参数，综合分析
自然光、灯光 细胞、组织等
载玻片 形态及染色 目镜×物镜、光学放大
人工 简单，单参数
二、散 射 光 的 测 量
细胞在液柱中与激光束相交时 向周围360°立体角方向散射的光 线信号，它的强弱与细胞的大小、 形状、胞内颗粒折射等有关，主要 分为前向散射光和侧向散射光。
流式细胞仪的原理介绍.ppt
流式细胞术的基本概念
流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以 流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精 确的对单个细胞理化特性（如大小、内部 结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行 多参数定量分析和分选的新技术。
流式细胞术的特点
流式细胞术最大的特点是能在保持细 胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏 的状态下，通过荧光探针的协助，从分子 水平上获取多种信号对细胞进行定量分析 或纯化分选。
吸取100ul的细胞(1 x 105)至试管中。 加进适量的荧光标记的annexin-V试剂和PI。 混匀后避光室温下孵育15分钟。（必须在室
温下进行） 孵育后加进400ul染色缓冲液，立即上流式细
胞仪分析。
Annexin-V和PI双染的特点和注意事项
此为血细胞分类的 基本原理，但不能分 析表面分子。
光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
三、荧 光 的 测 量
荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染 料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光 波长不同。
每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色 ，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长 的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光 电倍增管。
33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）
Caspases激活(Caspase-3 ) 线粒体跨膜电位降低 (Rhodamine123） 膜磷脂酰丝氨酸外化(Annexin V-FITC/PI) Ca2+ 浓度升高 (Fluo-3） DNA断裂及含量的变化 (TUNEL 和 PI）
前向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
侧 向 散 射 光（SS）
侧向散射光（side scatter, SS ）：激光束照射细胞时，光以90°角 散射的讯号，用于检测细胞内部结构 属性。
侧向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
光散射测量的用途
测得的FS与SS信 号通过计算机处理， 可得到FS-SS图，由 此可仅用散射光信号 对未染色的活细胞进 行分析或分选。
（一）参 数 说 明
FS：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少
（二）数 据 显 示 方 式
直分析方图
单参数直方图 双参数直方图:点图
二维等高图 假三维等高图 三参数直方图 多参数分析
1.单 参 数 直 方 图
由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数 (COUNT)构成，反映同样散射光或荧光 强度的颗粒数量的多少。
培养细胞的样品制备
蛋白酶消化 机械吹打 使贴壁细胞脱
落
洗涤
尼龙网过滤
单细胞悬液的制备与保存
新鲜实体组织单细胞悬液的制备
机械法 酶处理法 化学试剂处理法 表面活性剂处理法
单细胞悬液的保存
深低温保存法（一年） 乙醇或甲醇保存法（2周） 甲醛或多聚甲醛保存法（2月）
（三）流式细胞免疫学技术的质量控制
1.单细胞悬液制备的质控
适当的制备方式 实体组织来源标本用机械法 温度25-37℃，pH7.0-7.2
2. 免疫荧光染色的质控
温度 pH 染料浓度 固定剂
3. 仪器操作的质控
光路与流路校正: 确保激光光路与样品流处于正交 状态，减少变异（CV）。
红色荧光强 度
双参数直方图点图
绿色荧光强 度
（三）设 门 分 析 技 术 1.Gate设置：指根据该图的细胞群分 布选定其中想要分析的特定细胞群。
根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多 边形门、任意形状门和十字门。
A 淋巴细胞 B 单核细胞 C 中性粒细胞
A、B、C均为 任意门
线性门
细胞分选示意图
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴 不充电
弃去
含细胞的液滴 充电
偏转落入收集器
五、数 据 的 显 示 与 分 析
参数：FS,SS,FL 数据显示方式 （单参数直方图 、双参数散
点图 、二维等高图 、假三维等高图 、三参 数散点图 ） 设门分析技术
利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术， 保证检测的灵敏度和特异性；
用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多 个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与 统计分析精确性。
1.流式细胞仪的基本结构
（1） 液流系统 （2） 光学系统 （3） 数据处理系统
（1）液 流 系 统
由样本和鞘液组成
前 向 散 射 光（FS）
前向散射光（forward scatter, FS ）： 激光束照射细胞时，光以相 对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射 的讯号用于检测细胞等粒子的表面属 性，信号强弱与细胞体积大小成正比 。
通常在FCM应用中，选取FS作阈值，来排除样品中的各种 碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。
不易
易
易
对PH敏 感性 敏感
不敏感
特点
易溶于水，与抗体 结合不影响特异性 稳定，偶联后量子 产额低
不敏感 具较多发光基团， 消光系数和量子产 额高
不敏感 减少交叉，成本高
（三）免 疫 荧 光 标 记
荧光染料与细胞成分的四种结合方式 结构亲和式 嵌入结合 共价键结合 荧光标记抗体特异性结合
免疫荧光标记方法 直标:干扰少,但需购买多种单抗 间标:步骤多,干扰多,不需标记多种抗体
待测细胞
单个细胞的悬液
荧光
染料标记的单抗对其染色