骨髓间充质干细胞对大鼠急性肾损伤的保护作用刘源邢淑华*（徐州医学院药理学教研室江苏徐州221004）【摘要】目的：观察外源性骨髓间充质干细胞(MSCs)对庆大霉素诱导的大鼠急性肾损伤是否具有治疗作用，并探讨其机制。
方法：建立庆大霉素腹腔注射大鼠急性肾损伤模型。
SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、MSCs 治疗组、生理盐水组，于建模后4d处死大鼠，检测血尿素氮(BUN)及肌酐(Scr)水平，HE染色观察肾组织病理变化，免疫印迹及RT-PCR检测肾组织肝细胞生长因子（HGF）水平。
结果：模型组大鼠的BUN及Scr均显著高于正常对照组，肾小管损伤严重；而MSCs 治疗组大鼠的BUN及Scr水平较生理盐水组显著降低，肾小管损伤病理明显减轻。
此外，结果显示肝细胞生长因子（HGF）在MSCs治疗组肾组织内表达明显高于生理盐水组。
结论：MSCs输注可促进庆大霉素所致急性肾小管损伤的修复，其作用机制可能是通过上调肾组织中肝细胞细胞生长因子的表达。
【关键词】骨髓间充质干细胞；庆大霉素；急性肾损伤；肝细胞生长因子Role of bone marrow mesenchymal stem cells in the recovery of acute renal injury LIU Yuan, XING Shuhua. Department of Phamarcology, Xuzhou Medical College, Xuzhou Jiangsu, 221009Abstract Objective To investigate whether the exogenous mesenchymal stem cells can promote the recovery of acute renal injury induced by gentamycin sulphate and to explore its possible mechanism. Methods Acute renal injury rat model was established by intraperitoneal injection of gentamycin sulphate. SD rats were randomly divided into four groups which were normal control group, acute renal injury group, MSCs injection group and saline group. The changes of rat renal function and pathology were observed four days after the model established. The expression of hepatocyte growth factor in kidney were examined by western blot and RT-PCR. Results The levels of BUN and Scr in model group and saline infusion group were much higher than those in the normal control group. While comparing with those in saline group, the levels of BUN and Scr in the MSCs injection group were much lower. At the same time, expression of growth factors HGF were obviously higher in MSCs-treated kidneys. Conclusions Bone marrow mesenchymal stem cells can promote the recovery of acute renal tubular epithelial cells damage caused by Gentamycin Sulphate.The mechanism may partly depend on up-regulating the excretion of hepatocyte growth factor in renal mieroenvironment.Key words: mesenchymal stem cells, gentamycin sulphate, acute kidney injury, hepatocyte growth factor前言急性肾小管坏死(ATN)是急性肾功能衰竭(ARF)最主要的病因，是临床危重症之一。
而药物可直接导致肾小管坏死，如中成药，抗肿瘤药，抗菌药物等均可能导致肾损伤；其中，氨基糖苷类抗生素是诱发药源性肾损伤的最常见因素，而庆大霉素作为治疗革兰氏阴性菌感染有效的氨基糖苷类抗生素应用广泛。
因此，其对肾脏的毒性作用和导致急性肾小管坏死、急性肾衰竭的可能性不容忽视。
目前对包括药物所致的急性肾衰竭的治疗方法主要是替代治疗，其机制仅是维持机体内环境的稳定，被动的等待肾小管上皮细胞自身再生的修复。
因此，有待研究新的方法以主动促进ARF时肾小管的修复。
近年来，干细胞疗法在急慢性肾脏病治疗中的应用日益受到关注。
研究证实[1,2]干细胞移植能够明显改善肾小管损伤且有利于肾功能恢复。
目前研究较多的是来源于骨髓的间充质干细胞，该细胞在体内可分化为肾小管上皮细胞，可分泌肝细胞生长因子(HGF)以促进肾发育和急性肾损伤后肾小管重建[3-6]。
由于MSCs 具有易于获取、体外增殖能力强且性能稳定、低免疫原性等特点，使其在再生医学的应用中具有突出的优势[7]。
目前在动物和临床研究中，应用MSCs治疗一些损伤性、慢性、先天性、或免疫排斥性疾病都取得了很好的效果[8-11]。
鉴于MSCs的具有重要的临床应用潜能，本文旨在研究MSCs对庆大霉素诱导的大鼠急性肾损伤的治疗作用，并探讨其作用机制，深化对干细胞可塑性的认识，并为肾损伤的防治提供新的研究思路。
作者单位：221009 徐州，徐州医学院药理学教研室通讯作者：邢淑华，Email：xingshuhua@1.材料和方法1. 1动物分组健康SD大鼠40只，购自徐州医学院实验动物中心；其中雄性16只，重(100 ± 50) g，作为骨髓间充质干细胞移植的供鼠；雌性24只，重(230 ± 30) g，用于实验模型制作。
随机分为4组，每组6只大鼠：（1）正常对照组(N)、（2）ATN模型组(M)、（3）MSCs治疗组（模型+MSCs）、（4）生理盐水组(模型+生理盐水)。
1. 2MSCs 的分离和培养取健康成年SD大鼠(150 g左右)，颈椎脱臼处死，75%的乙醇浸泡5 min，无菌条件下分离双侧胫骨和股骨，剪除一侧骨骺端暴露骨髓腔，用注射器吸取2 ml培养液反复冲出骨髓腔内的细胞，接着通过200目的钢丝网，制成单细胞悬液。
将骨髓细胞接种于含有10%胎牛血清的L-DMEM培养液的培养瓶中，置于37 ℃、饱和湿度的5%，CO2培养箱中培养，待细胞长到80%融合时消化、传代，扩增培养，通过多次传代对细胞进行纯化。
取3代大鼠MSCs，用胰蛋白酶消化后收集，生理盐水重悬成1×106个细胞/ml 的细胞悬液，采用台盼兰拒染法检查细胞活力在95%以上，备用于细胞移植。
1. 3ATN模型的建立SD大鼠在接受注射前12h至注射后8h禁饮。
腹腔注射硫酸庆大霉素注射液100mg／(kg·d)，连续7d，实验结束后处死大鼠。
1. 4MSCs移植MSCs移植治疗组大鼠在腹腔注射庆大霉素后，立即开始MSCs移植，经尾静脉注入MSCs 悬液(细胞数为1×106)，生理盐水组，使用无菌生理盐水代替MSCs。
注射完毕，压迫止血。
正常对照组和ATN模型组不注射MSCs。
1. 5标本的采集及检测MSCs移植后第4天，将大鼠以10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，开胸，腹主动脉采血，生化试剂盒检测血尿素氮（BUN）和肌酐(Scr)水平；取部分肾脏新鲜组织冻存于液氮中，以待提取蛋白和RNA：其余组织以4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片。
1. 6 Western blot检测大鼠HGF 以下操作均在冰水浴中进行：从液氮中取出标本，称取每只大鼠标本100mg，加入1mlRAPI裂解液冰上裂解后超声匀浆，用恒温冷冻离心机( 4 ℃，12000 r/min )离心10 min，取上清，用EP管分装，作好标志。
置于- 80 ℃冰箱储存备用。
取等量蛋白的样品，进行聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE) 分离后，用湿转法电泳转膜，封闭液室温封闭2 h，然后加入1:200的HGF多克隆抗体，4 ℃过夜。
Washing buffer洗膜3次，每次5 min，加入二抗室温反应2 h，Washing buffer洗膜5次，每次3 min。
以NBT/BClP显色，结果以图像处理仪分析。
每个实验重复做3次( n= 3)。
1. 7 RT-PCR检测HGF mRNA 采用Trizol法提取新鲜冰冻组织RNA，按照试剂盒说明书进行。
取2μgRNA，按TIANGEN逆转录试剂盒的说明行逆转录。
所用因子的引物序列及扩增产物长度见表1。
PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，62 ℃(GAPDH)、54 ℃(HGF)退火30 s，72 ℃延伸60 s，最后72 ℃延伸5 min。
GAPDH和HGF的循环数分别为33、35。
上述产物经2％琼脂糖凝胶电泳(100 V)后，在紫外光照下观察摄片，用计算机图像分析仪扫描分析，测定各条带的信号面积和灰度，然后以同一样品的GAPDH信号值作校正。
mRNA=(HGF信号面积的灰度值)/(GAPDH信号面积的灰度值)。
每个实验重复做3次( n= 3) 。
表1 引物序列及扩增长度项目正义反义长度HGF GAGGCGAGGAGAAACGCAAAC ATCCACGACCAGGAACAATGAC 423bp GAPDH ATGGAAGAAGAAATCGCCGC ACACGCAGCTCGTTGTAGAA 269bp 1. 8统计学处理采用SPSS 16.0 统计软件，数据以x± s 表示，采用t检验进行组间比较，P< 0.05表示差异有统计学意义。
2.结果2. 1MSCs形态学观察经体外培养后，相差显微镜下可见大量大鼠MSCs细胞，荧光显微镜下观察显示所有MSCs呈梭形，边缘清晰整齐，贴壁生长，呈成纤维细胞形态生长，呈旋涡状(图1)。