实验二病料的采集、保存及送检一、目的掌握被检病料的采取、保存、送检的方法。

二、材料实验动物（鸡）、瓷盘、剪子、镊子、酒精灯、酒精、接种环、载玻片、火柴棒等。

三、病料的采取1.采取病料的基本原则(1)采集最适病料理想的病料，应是无菌采取的含病原微生物量高的血液、器官组织或分泌物和排泄物。

因此要根据疾病的病性采取合适的病料，如无法估计是何种疾病时，应根据临床症状和病理变化采集病料或全面采取病料。

取材时应注意病原微生物感染所致疾病的类型(如呼吸道感染疾病、胃肠道感染疾病、皮肤和粘膜性疾病、败血性疾病等)、病原微生物的侵入部位、病原微生物感染的靶器官等。

细菌检验病料应当是采自未经抗菌药物治疗的患病动物，并且应多做几张涂片。

(2)适时采集采集病料的时间一般在疾病流行早期、典型病急性期，此时病原微生物的检出率高；后期由于体内免疫力的产生，病原微生物减少，检测病原微生物比较困难，同时可能出现交叉感染，增加判断的困难性。

在采集供抗体测定用的血清时，可适时地采集急性期和恢复期的两份血清样品，一般两份血清的间隔时间为14～2ld。

内脏病料的采取，须于动物死后立即进行；夏季最迟不超过4～6h，冬天不超过24h，否则时间过长，由肠内侵入其他细菌，致使尸体腐败，有碍于病原菌的检出。

供做切片的样品采取后必须立即投入固定液，否则时间过长，会使细菌和组织细胞死亡、溶解，影响检验结果。

有条件做现场培养时，剖开尸体后应进行接种培养，然后采样，最后剖检。

(3)无菌操作采集病料所用的器械及容器要进行严格的消毒：刀、剪、镊子等金属用具可煮沸消毒30min，使用前最好用酒精擦拭，并在火焰上烧一下；器皿（玻制、陶制及珐琅制等）在高压灭菌器或干烤箱内灭菌；软木塞和橡皮塞应高压灭菌；载玻片用2%～5%碳酸钠煮沸消毒5～10min，煮沸后用清水冲洗干净，拭干保存或浸泡于95%酒精中以备使用；注射器和针头放于清洁水中煮沸30min即可，或用一次性注射器。

病料采取过程都应该无菌操作，尽量避免杂菌污染。

采取一种病料，使用一套器械，或器械酒精擦拭火焰灭菌后再采取另一种病料；一种病料放入一种容器，不可混放。

(4)剖前检查若有突然死亡或病因不明的尸体，须先采取末梢血液制成涂片，镜检，观察是否有炭疽杆菌存在。

若疑似炭疽时，不得进行解剖；如需要剖检并获取病料时，应经上级有关部门同意，选择合适的场地，做好严格的防范工作，剖后要进行严格的消毒处理。

只有在确定不是炭疽后，方可进行剖检。

2.病料采集的方法（1）液体材料一般用灭菌棉拭子采取破溃的脓汁、鼻液、阴道分泌物与排泄物。

未破的脓肿、胸水、腹水在皮肤表面消毒后，用无菌注射器抽取。

（2）血液无菌采取血液，供病原培养、抗体检测和血液检查之用。

体型较大的单蹄和偶蹄类动物少量血样可以从耳背静脉采血；毛皮动物少量采血可通过耳壳外侧静脉采取；鼠类可以通过尾尖、耳背静脉、眼窝内血管采血；兔可从耳背静脉、颈静脉、心脏等处采血；鸟类可以从肘关节内侧的翅静脉、跖部内静脉或心脏采血。

（3）乳汁乳房先用消毒药水洗净（取乳者的手也应事先消毒），并把乳房附近的毛刷湿，最初所挤的3～4股乳汁弃去，然后再采集10ml左右乳汁于灭菌试管中。

若仅供显微镜直接染色检查，则可于其中加入0.5%的福尔马林液。

（4）淋巴结及内脏组织应在尸体解剖后立即采取。

将淋巴结、肺、肝、脾及肾等有病变的部位各采取1～2cm3的小方块，分别置于灭菌容器中，并尽可能采取有病变及病变交界处的部位。

（5）胃肠及内容物可将胃肠剪下，两端扎好，送往实验室。

或用烧红的器具烧烙表面后穿一小孔，用灭菌棉拭子取其内容物，放入无菌的器皿内或放入装有生理盐水或PBS的试管内。

（6）脑、脊髓按病理解剖方法取出脑、脊髓。

取一部分放入10%福尔马林溶液的瓶中，供组织学检查；一部分放入50%甘油生理盐水瓶中，供微生物学检查。

或者将头部取下，用塑料口袋包好直接送检。

（7）胆汁先用烧红刀片或铁片烧烙胆囊表面，再用灭菌细管或注射器刺入胆囊内吸取胆汁，置于灭菌试管中。

（8）皮肤去大小约10×10cm2的皮肤一块，保存于30%甘油缓冲溶液中，或10%饱和盐水溶液中，或10%福尔马林液中。

（9）骨头需要完整的骨头时，应将附着的肌肉和韧带等全部除去，表面撒上食盐，然后包于浸过5%石炭酸水或0.1%升汞液的纱布或麻布中，装于木箱内送到实验室。

(10)流产胎儿及小动物尸体将流产胎儿及小动物尸体包入不透水塑料薄膜、油纸或油布中，装于木箱内送到实验室。

二、病料的保存1.常用保存剂的配制（1）30%甘油缓冲溶液纯中性甘油 30mlNaCl 0.5g碱性磷酸钠 1.0g0.02%酚红 1.5ml中性蒸流水加至 100ml 混合分装后，0.105Mpa高压灭菌30min（2）50%甘油缓冲盐水溶液NaCl 2.5g酸性磷酸钠 0.46g碱性磷酸钠 10.74g纯中性甘油 150ml中性蒸流水 150ml 混合分装后，0.105Mpa高压灭菌30min（3）10%福尔马林溶液取福尔马林10ml加入蒸馏水90ml即成。

（4）饱和盐水溶液取一定的蒸馏水加入纯NaCl，不断搅拌至不能溶解为止（一般为38%～39%左右），然后用滤纸过滤。

（5）鸡蛋生理盐水溶液先将新鲜鸡蛋的表面用碘酒消毒，然后打开内容物倾入灭菌的三角瓶中，加入灭菌盐水（占总量的10%），摇匀后，用无菌纱布过滤，然后加热至56～58℃30min，第2d及第3d按上法再加热一次，即可应用。

2.常用保存方法（1）液体病料检查抗体用的血液，不加抗凝剂，待凝血后，分离血清放入青霉素小瓶中。

供病原分离培养用的液体病料，同容器一起放入有冰的保温瓶或4℃冰箱内。

（2）供细菌学检验的实质脏器若1～2d内能送到实验室，可放在有冰的保温瓶或冰箱内，也可放入灭菌液体石蜡或30%甘油缓冲盐水内。

如无冰，也可在保温瓶内放氯化铵500g加水1500ml，使保温瓶内保持O℃左右达24h。

（3）供病毒学检验的实质脏器应尽快送检，如不能即刻送检而需要保存时，必须保持在冷的环境中，48h内送到实验室。

一般放在50%甘油缓冲盐水溶液或鸡蛋生理盐水溶液中，4℃保存最好，原因是冻化过程能使病毒破坏。

如需保存较长时间才能进行检查，最好放在一20℃以下或干冰中保存。

（4）病理组织病料采取的病料立即放入10倍体积的10%福尔马林溶液或95%～100%酒精中，如用10%福尔马林溶液固定组织时，经24h应重换新鲜液一次。

神经系统组织（脑、脊髓等），需固定于10%中性福尔马林溶液内（福尔马林溶液的总容积中加入5%～10%碳酸镁）。

在寒冷季节，为了避免病料冻结，在运送前，可将预先固定的病料置于含有30%～50%甘油的10%福尔马林溶液中。

三、病料的送检供细菌检验用的病料，要防止腐败，必须及时送检。

一般可用有冰块的保温瓶或其他低温条件，以使病料不腐败。

最好由专人送检，并带好送检的有关病情、病例、剖检等记录，以供检验人员的参考。

为避免散播病原，盛有病料的容器，瓶口要盖紧，用胶布封好或石蜡封固，并用消毒液充分擦拭容器的表面。

瓶上加贴标签，注明样品来源、种类、保存方法、采集时间等。

为避免病料外漏，应立放于金属筒内，填塞防震填充料(木屑、纸渣、稻草、塑料泡沫的渣屑等)。

实验三免疫接种一、目的掌握免疫接种的方法和步骤，熟悉生物制剂的保存、运送和用前检查方法。

二、内容及方法（一）免疫接种的方法按疫苗使用说明的方法接种，常用以下几种方法。

1.注射免疫操作简单，剂量准确。

（1）皮下注射法部位：马、牛等大家畜在颈侧，猪在耳根后方，家禽在胸部、大腿内侧。

先剪毛，用酒精或碘酒消毒，然后注入药液。

优点：操作简单，吸收较皮内快。

缺点：使用剂量多，反应较皮内大。

用途：疫苗和免疫血清。

（2）肌肉注射法部位：马、牛、猪、羊在臀部和颈部，家禽在胸部。

先剪毛，用洒精或碘酒消毒，然后把针头刺入肌肉，注入药液。

优点：操作简单，吸收快。

缺点：一个部位不能大量注射，臀部接种不当时易引起跛行。

用途：疫苗和血清。

（3）皮内注射法部位：马在颈侧、眼睑，牛羊在颈侧、尾根、肩胛中央，猪在耳根，鸡在肉髯。

优点：用量较少，反应小（副作用小），免疫力高（同量与皮下相比）。

缺点：比较麻烦。

用途：痘苗和诊断液。

（4）静脉注射部位：马牛羊在颈静脉，猪在耳静脉，鸡在翼下静脉。

优点：使用剂量大，见效快，可及时抢救病畜。

缺点：比较麻烦，易引起过敏反应（接种异种动物血清时，即血清病）。

用途：免疫血清。

2.皮肤刺种法鸡新城疫、鸡痘疫苗常用此法接种，选定翅内侧无血管处，用刺种针或钢笔尖蘸取疫苗刺入。

3.滴鼻或点眼法用滴管吸取疫苗滴在鼻孔内或眼结膜。

4.口服法用法：将疫苗混入饮水或拌入饲料通过饮水或采食经口免疫。

必须注意，饮水免疫前要停水4～6h，稀释疫苗的水要纯净，尤其不能用含有消毒剂的水稀释疫苗；用于拌疫苗的饲料要新鲜，不宜用酸败或发酵饲料，大小动物要分开喂，使其能均匀吃到含疫苗的饲料；口服免疫前后24h不得饮用任何消毒药物，用活菌制剂时不能应用抗菌药物。

优点：省时、省力。

缺点：每头（只）剂量不准。

5.喷雾法（1）使用仪器气雾发生器。

压力为2kg/cm2（使70%的微粒在1～10um）。

（2）分类室内气雾免疫动物进入室内，关闭门窗，喷头由门窗缝伸入，与动物头部同高，持续20～30min。

室外气雾免疫四周有矮墙的圈内，喷头与动物头同高，人员要走动，站上风，数分钟。

（3）注意操作者要防护自己，带大而厚的口罩穿工作服，胶靴，如出现症状，及时就医。

（4）影响因素雾化粒子大小1～10um，如过大被鼻粘膜阻止，过小吸入后被绒毛运动排除；风力、风速；温度、湿度。

（5）优点省时、省力。

适于大群动物免。

（6）缺点需要的疫苗数量多。

（二）疫苗的保存、运送和用前检查1.疫苗的保存按说明保存。

一般弱毒疫苗保存在—15℃以下，灭活疫苗在4～10℃。

2.疫苗的运送要求包装完善，防止碰坏瓶子和散播活的弱毒病原体，因此，运送疫苗，逐瓶包装，然后装箱。

弱毒疫苗（活疫苗）一般要求“冷链”运送，即需要冷藏工具如冷藏车、冷藏箱、保温瓶等，以免其性能降低或丧失。

严防在高温和日光下运输。

灭活苗运送中也要防止冻结和曝晒。

3.疫苗的用前检查玻璃瓶或安瓿应无破损，瓶塞应密封；瓶签上记载的名称、批号、有效期、容量、检查号码及使用方法等必须清楚；药品色泽及其物理性状必须和药品说明书上记载相符合，否则不得使用。

(三)免疫接种的组织工作接种时的组织工作是特别重要的，因为它可以决定全部措施的结果和成效。

接种时组织工作如下：1.进行免疫接种时，应事先取得当地场、队等领导的支持，并商请给以人力物力等保证。

并向有关人员宣传免疫接种的基本知识和注意事项等。

2.组织好接种人员，准备好场地和保定工具。

3.编订全部注射家畜的登记表册，进行编号，避免错乱而造成重复注射。