4
三、细胞工程的基本操作
1.
2. 3.
无菌操作技术
细胞培养技菌操作技术
• 细胞工程的所有实验都要求在无菌条件下 进行，实验操作成在无菌室内进行。无菌 室应定期用紫外线或化学试剂消毒，实验 前后还应各消毒一次。无菌室外有间缓冲 室，实验人员在此换鞋、更衣、戴帽，做 好准备后方可进入无菌室，操作时实验者 的双手应戴无菌手套。 • 注意周围环境的卫生整洁。 • 生物材料、一切器械、器皿和药品应进行 灭菌或除菌。
6
无菌操作
杀菌和消毒 物理法 化学试剂 抗生素 超净工作台
7
2、细胞培养技术
• 细胞培养是指动物、植物和微生物细胞在体外无菌 条件下的保存和生长。虽然这些细胞培养在营养要 求等方面有许多差异，但作为细胞培养，它们也有 些共同之处。 • 首先，要取材和除菌。除了淋巴细胞可直接抽取以 外，植物材料在取材后，动物材料在取材前都要用 一定的化学试剂进行严格的表面清洗、消毒。有时 还需要某些特定的酶对材料进行顶处理，以期得到 分散生长的细胞。 • 其次，根据各类细胞的特点，配制细胞培养基并进 行灭菌。将生物材料接种于培养基中，最后将接种 后的培养基放入培养室或培养箱中培养。当细胞达 到一定生物量时应及时收获或传代。
• 根据物理状态分：
固体培养基 半固体培养基 液体培养基
20
2）培养基的种类
• 按用途划分：
基础培养基 加富培养基（营养培养基） 鉴别培养基 选择培养基 其他培养基：分析培养基、还原性培养基等
21
3）培养方法
（1）固体培养； （2）液体培养； （3）连续培养； （4）中间补料培养； （5）同步培养； （6）混合培养。
16
1）培养基的组成
• 维生素
• 维生素是生物体生长不可缺少的一种或数种极微量 的有机物质，但微生物在生长时，自身往往又缺乏 合成这种有机物的能力，因此，必须由外界提供。 与微生物关系较大的维生素，主要是B族维生素。 • 作用：是微生物体内各种酶活性基团的组成部分。 直接参与生物催化剂——酶的形成及蛋白质、脂肪 的代谢。
14
1）培养基的组成
• 氮源
• 来源：无机氮源（氨气、铵盐或硝酸盐等）和有 机氮源（氨基酸、蛋白质或尿素、蛋白胨、牛肉 膏、酵母膏等）。 作用：构成微生物细胞、蛋白质和核酸的主要元 素。 细胞生长分化需氮。
15
1）培养基的组成
• 无机盐
• 大量元素：每升培养基含0.5毫摩尔以上。 微量元素：每升培养基含0.5毫摩尔以下。 大量元素：P、K、Mg、S、Ca等； 微量元素：钴、铜、铁、锰、钼、锌等。 作用：构成菌体的组成； 作为酶活性基团的组成部分； 调节微生物体内的pH值。
•水
• 培养基大部分是水
来源：不含或少含某些离子的重蒸水（双蒸水） 或去离子水。 目的：保持培养基成分完全人为控制。 • 作用：起媒介作用 组成作物体（占75～80%） 提供O、H元素 运输物质、调节渗透压
19
2）培养基的种类
• 按成分不同划分：
天然培养基：含有化学成分还不清楚或化学成分 不 恒定的天然有机物。 合成培养基：由化学成分完全了解的物质配制而 成的培养基。
17
1）培养基的组成
• 维生素C（抗坏血酸）：强还原能力，防组 织氧化变褐。 B1（硫胺素）：促愈伤组织产生，与愈伤 组织活力有关。 B2（烟酸或维生素PP）：促代谢，促胚的 发育，高浓度会抑制生长。 B6（吡哆醇）：促根生长。 肌醇（环己六醇）：无促进生长的作用， 但有助活性物质发挥作用。
18
1）培养基的组成
8
9
3、细胞融合技术
• 两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重 排，导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的过程 称为细胞融合。 • 细胞融合是细胞工程的重要基本技术，其主要过程 包括：①制备原生质体。由于微生物及植物细胞具 坚硬的细胞壁，因此通常需用酶将细胞壁降解。动 物细胞则无此障碍。②诱导细胞融合。两亲本细胞 (原生质体)的悬浮液调至一定细胞密度；按1：1的 比例混合后，用物理、化学或生物的方法促进融合。 ③筛选杂合细胞。将上述混合液移到特定的筛选培 养基上，让杂合细胞有选择地长出，其他未融合细 胞无法生长。以获得具有双亲遗传特性的杂合细胞。
10
细胞融合技术
– 制备原生质体 – 诱导细胞融合
• 化学法
• 物理法 • 生物法
– 筛选杂合细胞
11
四、细胞培养技术
1、微生物细胞培养
2、植物细胞培养
3、动物细胞培养
12
1、微生物细胞培养
1）培养基的组成 • 碳源 • 氮源 • 无机盐 • 维生素 •水
13
1）培养基的组成
• 碳源
• 蔗糖、萄葡糖、果糖、麦芽糖、纤维二糖或多 糖类的可溶性淀粉、糊精及果胶；由其他谷物、 马铃薯、红薯、木薯等得到的糖类物质。 作用：维持培养基的合适渗透压； 构造微生物体； 参与新陈代谢。 注意:不同浓度影响细胞的增殖分化。
微 生 物 细 胞 培 养
微 生 物 细 胞 杂 交
动 物 细 胞 培 养
动 物 细 胞 融 合
单 克 隆 抗 体
胚 核 胎 移 移 植 植
2
二、发展史
• 1838～1839年提出细胞学说； 1902年提出细胞全能性； 细胞全能性：植物细胞具有原植物的全部遗 传性，单细胞经人工培养，通过细胞分裂而 恢复成完整植株。 1904年用胡萝卜胚培养成株，三十年代获愈 伤组织。 1948年发现腺嘌呤，生长素对芽形成的影响， 建立腺嘌呤/生长素的比例控制芽根分化。
3
二、发展史
• 1956年发现激动素促芽形成效果高，促组培工作研 究； 六十年代从曼陀萝花药培养获植株建花培技术； 1972年细胞融合成功； 1912年培养动物细胞； 1958年获细胞融合（种间、腹水癌细胞+病毒） 六十年代初换核术成功； 1975年获杂交瘤； 我国70年代中开始细胞融合； 现有40多种花粉植株，在我国首次成功。
一、细胞工程的内容
• 根据其研究对象不同，分为植 物细胞工程、动物细胞工程和 微生物细胞工程。 • 细胞是细胞工程操作的主要对 象。
– 原核细胞
• 细菌、放线菌
– 真核细胞
• 酵母菌、动物细胞、植物细 胞
1
细胞工程
植物细胞工程 微生物细胞工程 动物细胞工程
植 物 组 织 培 养
植 物 体 细 胞 杂 交