mRNA为模板
等反应合成双链cDNA cDNA分子分别插入载体形成重组 等反应合成双链cDNA ，各cDNA分子分别插入载体形成重组 再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的cDNA cDNA的集 子，再导入宿主细胞克隆扩增。这
1 目的基因的获取
1.1 化学合成法：已知序列 化学合成
一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞， 一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进 行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合， DNA片段的集合 行克隆。这些存在于所有重组库，它包含了该生物的所有基因。用于研究基因 在基因组中的情况。 在基因组中的情况。
重组DNA技术 又名基因工程 技术(又名基因工程 重组 技术 又名基因工程) (recombinant DNA technology )
定义： 定义：
实现基因克隆所采用的方法及相关的工作统称为重组 DNA技术，又称基因工程。 技术， 技术 又称基因工程。 广义的基因工程指按人们意愿设计， 广义的基因工程指按人们意愿设计，通过改造基因或基 因组而改变生物的遗传特性。如用重组DNA技术，将外源 技术， 因组而改变生物的遗传特性。如用重组 技术 基因转入大肠杆菌中表达， 基因转入大肠杆菌中表达，使大肠杆菌能够生产人所需要的 产品；将外源基因转入动物， 产品；将外源基因转入动物，构建具有新遗传特性的转基因 动物；用基因敲除手段，获得有遗传缺陷的动物等。 动物；用基因敲除手段，获得有遗传缺陷的动物等。
含pUC119-u6的白色 pUC119-u6的白色 菌落
混合有氨苄青霉素的平板
基因克隆基本步骤
分离目的基因）： ）：从生物体复杂的基因组中分离出 （1）分（分离目的基因）：从生物体复杂的基因组中分离出 所需要的DNA片段，即目的基因 所需要的DNA片段， DNA片段 切割目的基因和基因载体）： ）：用限制性内切核酸酶 （2）切（切割目的基因和基因载体）：用限制性内切核酸酶 切割目的基因和基因载体，以利于将两者连接形成重组体。 切割目的基因和基因载体，以利于将两者连接形成重组体。 连接目的基因和基因载体）： ）：在体外将目的基因连 （3）接（连接目的基因和基因载体）：在体外将目的基因连 接到能够自我复制的载体DNA分子上，形成重组DNA（ 接到能够自我复制的载体DNA分子上，形成重组DNA（重组 DNA分子上 DNA 体）。
3 外源基因与载体的连接
粘性末端连接： ①粘性末端连接： GGATCC CCTAGG 平头末端连接： ②平头末端连接： GTCGAC CAGCTG
③同聚寡核苷酸末端连接 AAAGAC GTC + CTG CAGTTT ④人工接头分子连接： 人工接头分子连接： GGATCC CCTAGG
四 重组DNA导入宿主细胞
DNA克隆常用的载体有：质粒载体(plasmid) (plasmid)， DNA克隆常用的载体有：质粒载体(plasmid)，噬菌体载体 克隆常用的载体有
(phage)、柯斯质粒载体(cosimid)、单链DNA噬菌体载体 (phage)、柯斯质粒载体(cosimid)、单链DNA噬菌体载体 (cosimid) DNA phage)、噬粒载体(phagemid)及酵母人工染色体(YAC) (phagemid)及酵母人工染色体 (ssDNA phage)、噬粒载体(phagemid)及酵母人工染色体(YAC) 等。
大肠杆菌感受态的制备、 大肠杆菌感受态的制备、 重组DNA DNA的转化和抗药性筛选 重组DNA的转化和抗药性筛选
朱文博 中山医学院
基因克隆(又名分子克隆， 克隆) 基因克隆 又名分子克隆，DNA克隆 又名分子克隆 克隆 (gene cloning)
通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接 通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、 体外重组技术 DNA经切割 插入适当载体，并导入受体细胞， 插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量 子代分子的过程。 子代分子的过程。 基因克隆的核心----体外重组(Recombination) 基因克隆的核心----体外重组(Recombination) : ----体外重组 人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。 DNA插入一个载体的过程 人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。
转化(transformation)或转染 或转染(transfection)：通 ①转化 或转染
过特殊的处理方法将外源遗传物质(如质粒DNA等 过特殊的处理方法将外源遗传物质(如质粒DNA等)导入原核 DNA 或真核细胞，引起遗传性状变化的现象。 或真核细胞，引起遗传性状变化的现象。
②感染(infection)：病毒类侵染宿主菌的过程称为感染， 感染 ：病毒类侵染宿主菌的过程称为感染，
2 CaCl2法制备感受态细胞和转化的原理
一般受体菌对重组DNA分子的摄取能力很低， DNA分子的摄取能力很低 1. 一般受体菌对重组DNA分子的摄取能力很低，难以转化成 当细菌处于冰冷 冰冷（ 05低渗溶液中 功 。 当细菌处于 冰冷 （ 0℃ ） 0.05-0.1M 的 CaCl2 低渗溶液 中 ， 菌体的细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性增加， DNA的摄取 菌体的细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性增加，对DNA的摄取 能力增强，转化效率提高（感受态细菌） 能力增强，转化效率提高（感受态细菌）。 在转化体系中形成DNA DNA- DNase的羟基 的羟基－ 2. 在转化体系中形成 DNA- 抗 DNase 的羟基 － 磷酸钙复合物能 粘附于细菌表面， 经过42 短时间热休克（ 42℃ shock） 粘附于细菌表面 ， 经过 42℃ 短时间热休克 （ heat shock ） 处 细胞膜的液晶结构发生扰动， 理 ， 细胞膜的液晶结构发生扰动 ， 出现间隙促进感受态细胞 吸收DNA复合物。 DNA复合物 吸收DNA复合物。 丰富培养基上生长1 小时后 球状细胞复原并分裂增殖， 3. 在 丰富培养基上生长 1 小时 后 ， 球状细胞复原并分裂增殖 ， 重组子中的基因在转化细菌中得到表达，在选择性培养 culture)平板上即可筛选出所需的转化子 平板上即可筛选出所需的转化子。 (selective culture)平板上即可筛选出所需的转化子。
基因克隆示意图
分、切
载载DNA (限限限限限限限限) 限
＋
目目目 目
接
宿宿宿宿
＋
重重 载
转
已 已 已 目 宿宿 宿 宿
繁繁
筛
阳 限 阳 阳阳
表表
大肠)
宿主细胞处于容易吸收外源性DNA的状态， 宿主细胞处于容易吸收外源性DNA的状态，处于感 DNA的状态 受态的细胞称为感受态细胞. 受态的细胞称为感受态细胞.
1、CaCl2转化程序法：传统方法,转化效率能达到5×106转化程序法：传统方法,转化效率能达到5
2×107转化子/µg质粒DNA,简单、快速、重复性好、菌株适用范 转化子/ 质粒DNA,简单、快速、重复性好、 DNA,简单 围广。 围广。
2、电穿孔转化法； 电穿孔转化法； 脂质体(liposome) (liposome)法 3、脂质体(liposome)法； 胞核的显微注射法(microinjection) (microinjection)； 4、胞核的显微注射法(microinjection)； 磷酸钙介导的转染； 5、磷酸钙介导的转染； 聚乙二醇介导的原生质体转化法。 6、聚乙二醇介导的原生质体转化法。
1.1 制备感受态细胞的原理
正常细胞都有细胞膜（细菌还有细胞壁）作屏障， 正常细胞都有细胞膜（细菌还有细胞壁）作屏障， 对外源分子选择性接受。在实验中通过一定的理化 对外源分子选择性接受。 条件使细胞通透性增大，处于感受态。 条件使细胞通透性增大，处于感受态。
1.2 制备感受态细胞和转化的常用方法
（4）转（转化至宿主细胞）：将重组体引入（转化或转染） 转化至宿主细胞）：将重组体引入（转化或转染） ）：将重组体引入 到宿主细胞（受体细胞） 到宿主细胞（受体细胞）中，转化后的细胞进行扩增繁殖， 转化后的细胞进行扩增繁殖， 获得大量的细胞繁殖群体。 （5）筛（筛选阳性细胞克隆）：从大量的细胞繁殖群体中 筛选阳性细胞克隆）： ）：从大量的细胞繁殖群体中 筛选出转化成功（带有重组体）的阳性细胞克隆。 筛选出转化成功（带有重组体）的阳性细胞克隆。
3 实 验 步 骤
弃上清，将管倒置于滤纸上 弃上清，将管倒置于滤纸上1min，使液体流干净 ， 沉淀中加入冰冷的0.1mol/L CaCl2 110 µ l，重悬菌体。 沉淀中加入冰冷的 ，重悬菌体。 取感受态细菌100µl转移到一无菌的 µ 转移到一无菌的 转移到一无菌的1.5ml的EP管中 取感受态细菌 的 管中 每管加入质粒5µl 每管加入质粒 µ 轻轻旋转EP管 混匀混合物，在冰浴上放置 轻轻旋转 管，混匀混合物，在冰浴上放置20min 试管放入42 的水浴中 放置90s，不要摇动 管 的水浴中， 试管放入 0C的水浴中，放置 ，不要摇动EP管 迅速将试管转移到冰浴，冷却 迅速将试管转移到冰浴，冷却1~2min 取出EP管，每管加入LB培养基 取出 管 每管加入 培养基800 µl 培养基 置于37 摇床 摇床（ ），温和震荡 置于 0C摇床（100~150r/min），温和震荡 ），温和震荡45min
聚合酶链反应(PCR): 1.4 聚合酶链反应(PCR):广泛采用
2 克隆载体的选择和构建
基因工程的载体应具有一些基本的性质： 基因工程的载体应具有一些基本的性质：
1）在宿主细胞中有独立的复制和表达的能力 2）分子量尽可能小 3）载体分子中最好具有两个以上的容易检测的遗传标记 4）载体本身最好具有尽可能多的限制酶单一切点。
重组体克隆的筛选与鉴定
由于重组率和转化率不可能达到理想极限， 由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因 此必须借助各种筛选和鉴定方法得到含有重组DNA 此必须借助各种筛选和鉴定方法得到含有重组DNA 的阳性克隆。
不含质粒的细菌