分子生物学实验
生物科学
分子生物学实验技术
分子生物学研究
植物基因组DNA提取
基因组DNA的琼脂糖电泳检测
分子实验的Primer设计 PCR扩增反应 PCR产物的电泳检测
DNA的提取和纯化
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实验目的
实验仪器及药品
实验步骤
实验目的
了解CTAB法抽提植物基因组DNA的原理; 熟悉分子生物学常用仪器设备的使用及常用试 剂的配制方法; 掌握植物基因组DNA的提取方法; 掌握真核生物基因组DNA分离和纯化方法; 了解不同染色体倍性生物基因组DNA的含量差 异。
实验仪器及药品
仪器:1.5mL离心管、水浴锅、研钵、研棒、离心 机、超净工作台、冰箱、移液枪、枪头、液氮 罐、高压灭菌锅等。 试剂:EasyPure Plant Genomic DNA Kit
实验步骤
Step 1 Step 2
Step 3
Step 4
细胞的 破碎
核酸的 纯化
核酸的 浓缩和 沉淀
核酸的 贮存
用primer5.0进行设计
6、点击1发现Hairpin、Dimer、False Priming和Cross Dimer 都没有找到,说明这个符合要求。
用primer5.0进行设计
6、点击2发现Hairpin、Dimer出现了Found说明这个不符合要求, 我们要符合要求的。
用primer5.0进行设计
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适 的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA 序列。因此,引物的优劣直接关系到PCR的特 异性与成功与否。要设计引物首先要找到 DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的 片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链 能形成二级结构,就要避开它。如这一段不能 形成二级结构,那就可以在这一区域设计引物。 现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一 般引物长度为15~30碱基,扩增片段长度为 100~600碱基对。
试剂盒提取的主要步骤
基因组DNA的琼脂糖电泳检测 实验原理 实验设备及药品 实验内容
实验原理
DNA在琼脂糖凝胶中的电泳,涉及电荷效应 和分子筛效应。
1、电荷效应
在微碱性的电泳缓冲液中,DNA分子中的磷 酸基因发生解离,带有电量的负电荷,能在电
场中向正极迁NA的PCR扩增
PCR技术的原理:聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction),简称PCR, 由Mullis于1985年创立,1987年获得专利, 1989年被美国著名《science》杂志列为十 项重大科技发明之首,1993年获诺贝尔化 学奖。如今,PCR技术已成为分子克隆工作 中必备的基本技术之一,并广泛渗透到医学 分子基因诊断、法医、考古学等诸多领域。 可以说PCR技术的发明给整个生命科学都带 来了一场革命,同时也为目的基因的快速克 隆提供了一种非常有效的手段。PCR的基本 原理如图所示。
琼脂糖凝胶的染色与观察
琼脂糖凝胶的染色与观察
琼脂糖凝胶的染色与观察
根据电泳后DNA条带的相对位置,可以估计出DNA的大小。 我们可以在DNA样品电泳的同时,在相邻泳道加入DNA分子 量标准物,即所谓的“DNA Marker”。DNA Marker在凝胶中 电泳后呈现出多个DNA条带,每个DNA条带有着固定的长度, 这样根据目的DNA条带与Marker中DNA条带的相对位置,就 可以方便地估计出目的DNA的大小
【操作步骤】
1、从NCBI中获取目的片段 2、用primer5.0进行设计
从NCBI中获取目的片段
1:登陆美国国立生物技术公信息中心(NCBI National center for biotechnology information )网站, /。点击搜索框,输入你需要 查找的种名。点击search。
CTAB法的原理
CTAB(cetyltrimethylammonium bromide)十六烷基 三甲基溴化铵是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜, 它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中(≥0.7mol/L NaCl)是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度(0.3mol /L NaCl)时,从溶液中沉淀,通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开,然后将 CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液,再加入乙 醇使核酸沉淀,CTAB能溶解于乙醇随之被除去。
实验设备及药品
移液器,枪头,水 平凝胶电泳槽,稳 压电泳仪,微波炉, 250ml三角瓶 琼脂糖,0.5×TBE (0.025mol/L Tris-硼 酸 0.001mol/L EDTA 采用无菌水溶解混 匀,溶液体积为1L), 6×DNA Loading Buffer。
实验内容
(1)1%琼脂糖凝胶的制备:称取0.2g琼脂糖 于250mL三角瓶中,加入20mL 0.5×TBE电泳 缓冲液,微波炉加热约1min使之溶解,然后拿 出观察是否有油状物,有则再次加热30s,等其 完全溶解拿出。加入2μLGelStain(10000×) 染色液,倒入制胶板,完全冷却后,拔出梳子, 形成完整的加样孔,置于电泳缓冲液中。 注意:①微波炉加热时防止溶液沸腾溢出;
7、我们将所需要的引物序列记下来,可以发到专门的公司进行 引物制作。
DNA的PCR扩增
PCR技术具有快速、简便、灵敏等特 点,已被广泛地应用于分子生物学等各 个领域。本实验是对提取出的DNA进行 PCR扩增,反应后可以通过电泳检测片段 的扩增结果。通过此实验学习PCR反应的 基本操作步骤和实验原理。
从NCBI中获取目的片段
2:在出现的新的界面中找到Genomes,在这个门类下找到 Nucleotide,进入另一界面。
从NCBI中获取目的片段
3:在出现的新的界面中查找你所需要的基因序列,进入另一界 面。
从NCBI中获取目的片段
4:找一篇点进去即可看到DNA序列。
用primer5.0进行设计
2、分子筛效应 由于一定浓度的琼脂糖凝胶具有一定的孔径大小,不
同分子量大小的DNA分子,在凝胶中迁移时受到的
空间位阻是不同的,分子量小的DNA分子,受到的
空间位阻小,在凝胶中的迁移速度快,而分子量大的
DNA分子,所受到的空间位阻大,在凝胶中的迁移 速度就慢,这样经过一定时间的电泳,不同分子量大 小的DNA分子就得以分离,这就是所谓的“分子筛 效应”。
PCR引物的设计原则
引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异 性。 产物不能形成二级结构。 引物长度一般在15~30碱基之间。 G+C含量在40%~60%之间。 碱基要随机分布。 引物自身不能有连续4个碱基的互补。 引物之间不能有连续4个碱基的互补。 引物5′端可以修饰。 引物3′端不可修饰。 引物3′端要避开密码子的第3位。
实验材料
仪器:PCR仪,EP管,移液器,枪头; 主要试剂:DNA,引物,无菌双蒸水, dNTP,2×Easy Taq SuperMix。
实验内容
1、稀释DNA:取5μL提取的DNA于1.5mlEP管中,加45μL的无菌 双蒸水,做成工作液。 2、选用适当量程的移液器与枪头,在0.2mL离心管中依次加入以下 成分(总体积10μL): ddH2O 3.0 μL 引物 R 0.5 μL 引物 F 0.5 μL DNA 1.0 μL 2×Easy Taq SuperMix 5.0 μL
琼脂糖凝胶的分辨率
凝胶浓度 0.5%
0.8% 1.0% 1.2% 1.5% 2.0%
分辨率(分离范围) 1,000-30,000 bp
800-12,000 bp 500-10,000 bp 400-7,000 bp 200-3,000 bp 100-1,500 bp
应用 未消化的基因组DNA
消化的基因组 DNA 质粒 DNA PCR产物和质粒 DNA PCR产物和质粒 DNA PCR产物
用primer5.0进行设计
下面复制我们需要的DNA序列到primer软件中。 1、打开primer5.0,点击File,New,DNASequence。
用primer5.0进行设计
2、把我们在NCBI上找的DNA序列粘贴进去(ctrl+v)。选择As Is,点击ok。
用primer5.0进行设计
3、点击primer,出现一个新的窗口,点击search。
用primer5.0进行设计
4、选择PCR Primers,Pairs。PCR product Size尽量选择范围 大一点,Primer Length在20上下浮动就可以。点击ok。
用primer5.0进行设计
5、出现新窗口,点击ok。出现Search Results。Rating有100 最好。然后点击1、2、3、4等进行选择。
琼脂糖凝胶的染色与观察
经过一段时间的电泳之后,不同分子量大小的DNA分子已经 相互分离,但是DNA分子在凝胶中无色无味,要想肉眼观察到, 就必须借助一定的染色技术,即采用EB(溴化乙锭)染色。EB具 有跟DNA中的碱基类似的平面结构,能够镶嵌到碱基对之间(见 图1)。在紫外灯的照射下,DNA所吸收的260nm的紫外光传递给 EB,以及EB本身在300nm、360nm吸收的射线,在可见光谱的红 橙区都将以590nm波长发射出来。这样,就能够在紫外灯下观察 到凝胶中DNA所在区域的条带(见图2)。 本实验用的是GelStain(10000×)染色液,有无毒的特点。
基因克隆特异PCR引物的设计
实验目的: 掌握PCR引物设计的基本原理
学习primer5.0的使用方法
实验原理
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷 酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列。 要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时 应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这 个区域单链能形成二级结构,就要避开它。不要有聚 嘌呤或聚嘧啶存在。否则引物设计的就不合理。应重 新寻找区域设计引物。引物确定以后,可以对引物进 行必要的修饰,但3′端绝对不能进行任何修饰,因 为引物的延伸是从3′端开始的。