云南大学生命科学实验教学中心实验报告课程名称：细胞工程实验院系：生命科学学院年级专业：2013级生物技术（国家生命科学与技术姓名：杨梦梅选课号：2015107066学号：20131070156座号：A2开课日期：2015.09 学期：2015秋季学期任课教师：吕琦、牛芸云南大学生命科学实验教学中心制胡萝卜愈伤组织的诱导、继代及细胞悬浮培养研究第一作者：杨梦梅同组实验者：赵姗( 云南大学生命科学学院,昆明650504)摘要: 以胡萝卜肉质根为外植体诱导出愈伤组织, 并建立细胞悬浮系. 实验结果表明: 胡萝卜肉质根是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的可行外植体; 诱导致密型愈伤组织的最佳激素浓度配比是 0.5 mg/ L 2, 4- D+ 0.4 mg/ L KT;继代培养 1代~ 2时,可得到高活性的悬浮细胞系；细胞悬浮培养细胞经过 14 天达到高峰期（生长平台）。

关键词: 胡萝卜; 组织培养; 细胞悬浮培养; 致密型愈伤组织;The study about inducement, subculture and suspension celllines of Carrots’ callusAbstract: Carrots’ flesh roots can induce callus as explants, and then it establishes suspension cell lines. The experimental results show that: Carrot s’flesh roots really can induce callus and then make suspension cell lines. In order to induce high density callus, the best hormone ratio is 0.5 mg/ L 2, 4- D+ 0.4 mg/ L KT. Subculturing the cell line for 1 to 2 times, we can obtain the suspension cell line with high activity. After 2 weeks, the cell line reaches to the peak of growth.Keywords: Carrot; tissue culture experiments; suspension cell; callus in high density胡萝卜( Daucus carota L . ) , 属于十字花科植物, 是一种十分重要的蔬菜作物, 由于胡萝卜肉质根营养丰富，约含有88％的水、6％～8％糖、1％～2％植物纤维，0．7％～1．2％蛋白质、1％灰份及0～3％脂肪，及其适于生食、加工、烹调等多种用途, 在世界范围内广泛栽培。

中国是农业大国, 胡萝卜作为蔬菜作物在人们生活中起着重要的作用。

因此, 加快我国胡萝卜育种研究以成为迫切需要。

近些年来, 随着生物技术与分子生物学技术的快速发展, 作为生物技术研究的理想材料, 许多国家对胡萝卜体细胞杂交技术、遗传转化与再生技术、分子标记与基因克隆技术进行了广泛深入的研究。

我国科研工作者在胡萝卜的生物技术与分子生物学研究上也取得了一定进展, 特别是在组织培养、原生质体融合、遗传转化及再生等方面。

但是在胡萝卜细胞培养方面并不是太多, 因此继续深入研究还是很有必要的。

本文对胡萝卜愈伤组织诱导的最佳培养基和细胞悬浮培养的条件进行探讨, 为其次生代谢产物α- 胡萝卜素、β- 胡萝卜素（维生素A前体）的生产以及将来的工厂化和分子生物学研究打下基础。

1 材料和方法1. 1材料来源胡萝卜肉质根自农贸市场购买.1. 2 方法1. 2. 1MS培养基的配制1000ml1)用大烧杯取蒸馏水100-120ml2)依次用移液管量取加入母液：100ml大量（10x）、100ml大量钙盐（10x）、10ml微量I（100x）、1ml微量II（1000x）、10ml铁盐（100x）、10ml有机（100x）、100ml有机肌醇（10x）、以及适当含量植物激素。

3)称取30g蔗糖加入，搅拌直至全部溶解，作为1号溶液备用。

4)称取9g琼脂，用量筒量取500ml蒸馏水一起加入1000ml体积白瓷缸中，放在电炉上一边加热一边搅拌，加热直至清澈无沉淀。

将1号溶液加入，继续加热搅拌，至将要沸腾，离火。

5)用pH试纸调pH至5.8-6.0 。

6)在白瓷缸中定容至1000ml，搅拌均匀。

7)分装至350ml培养瓶中每瓶约40~50ml。

121℃高压灭菌20min。

探究实验：培养基代号基本培养基2，4-D mg/L KT mg/LM1 MS 无无M2 MS 1 无M3 MS 2 0.5M4 MS 无 11. 2. 2胡萝卜愈伤组织的诱导( 1) 以胡萝卜肉质根形成层为外植体诱导。

用自来水洗净胡萝卜肉质根, 用小刀切成长约6~7cm块段, 将其在 75% 的酒精中消毒 60s, 再用0. 1% 的升汞消毒 10min或用20%次氯酸钠水溶液消毒20min, 最后用无菌水漂洗三遍每遍5~10min..（2）消毒好的胡萝卜根块, 切去形态学下端的5~10mm厚的一片, 留下部分用消毒好的小刀,沿截面横切成厚度 3~5mm 左右的小圆片, 然后将小圆片的韧皮部和木质部切去, 留下形成层, 再切成长 3mm, 宽 1. 5mm, 高 3~5mm 的小长块, 分别接种在M1、M2、M3、M4的诱导培养基上.（3）获得愈伤后进行继代培养, 培养环境条件与诱导培养相同.1. 2. 3胡萝卜愈伤组织的继代（1）从培养瓶中取出愈伤组织，置于无菌培养皿内，用解剖刀将愈伤组织坏死部分剔除并将愈伤组织切成黄豆大小颗粒，放在无激素的新鲜培养基表面，用镊子轻轻压实，每个培养瓶接种2~3个切块。

用记号笔标注操作者、组别和日期。

（2）3~4周后在相同培养基上继代培养1次。

1. 2. 4胡萝卜细胞无菌系的建立悬浮培养（1）用镊子夹取在固体继代培养基上继代 10d 左右的胚性愈伤组织即分散性好、疏松的愈伤, 称取鲜重2g左右的胡萝卜愈伤组织，在灭过菌的培养皿中用无菌镊子尽量将其拨散。

（2）将散碎的愈伤组织转移入盛有20ml液体无激素MS培养基的三角瓶中。

（3）置于80~120r/min摇床上25℃暗培养。

（4）每隔3天换液1次，用吸管吸去3/4旧培养液，再加入等量新鲜培养液。

连续培养2 代~ 4 代后逐渐形成稳定的细胞系。

1.2.5胡萝卜细胞再分化实验构建——胡萝卜愈伤组织的“器官分化”与“体细胞胚发生”（1）在超净工作台上，用镊子去除继代培养1~2次的疏松愈伤组织，在无菌载台上分割成长 3mm, 宽 1. 5mm, 高 3~5mm 的小长块，去除黑色、灰色或棕色的坏死细胞部分。

（2）接种在M5、M6培养基上，每瓶1~3块，轻轻压实，以保证和培养基充分接触。

（3)标注清楚组别和日期。

26℃，光照16h/d，4周后观察实验结果。

2 实验结果2. 1实验结果记录：2.1.1培养基配置结果：我们组负责配置的是M1，M2，M3，M4每种各接种两瓶。

2.1.2愈伤组织诱导结果：总接种瓶数8瓶总接种块数23块污染瓶数3瓶污染块数 5未污染瓶数5瓶未污染块数18块未污染块中愈伤组织发生块数15愈伤组织发生率83.33%愈伤组织发生情况记录18块接种成功，其中有11块愈伤组织的色泽较新鲜呈近乎白色，7块颜色偏深黄，浑浊。

污染情况及原因分析未成功的3瓶中，污染瓶中，有1瓶是霉菌污染，分析原因为培养基内水分过多，因此要选择水分适宜的培养基；1瓶细菌污染，可能是接种过程中接种器械消毒不够，掀开封口膜时碰到了封口膜里面，也可能是封口膜没绑好；一瓶为在接种过程中胡萝卜组织被烫伤，分析原因为手术刀在灼烧后没有完全冷却就使用，导致胡萝卜切面被烫伤。

2.1.3愈伤组织继代培养结果：总接种瓶数4瓶总接种块数11污染瓶数 2 污染块数 5未污染瓶数 2 未污染块数 6未污染块中愈伤组织发生块数 6愈伤组织发生率100%愈伤组织发生情况记录6块接种成功，其中有4块愈伤组织的色泽较新鲜呈浅黄色，2块颜色偏深黄，浑浊。

污染情况及原因分析两瓶都是在接种过程中胡萝卜组织被烫伤，分析原因为手术刀在灼烧后没有完全冷却就使用，导致胡萝卜切面被烫伤。

2.1.4胡萝卜细胞无菌系的建立悬浮培养结果：（以大组8~12人统计结果）瓶号接种质量g 3天后质量g 6天后质量g 14天后质量g 平均每天增值质量g1 1.98 2.00 2.73 3.90 0.142.1.5胡萝卜细胞再分化实验构建——胡萝卜愈伤组织的“器官分化”与“体细胞胚发生”结果：因实验培养时间问题，还未观察到具体结果。

预测实验结果为：如果愈伤组织脱分化以后进行再分化，则应当先时愈伤组织下部分化出根，在上部发育出芽，随着不断地生长，最终发育成完整的植株；如果是体细胞胚发生，则可以不经过愈伤组织阶段就可以发育为体细胞胚；但是体细胞胚比愈伤组织难生成得多，很多植物还无法进行体细胞胚的诱导生成，体细胞胚一旦形成，便可慢慢的分化为完整的植株。

与愈伤组织发生相比，体细胞胚更不容易发生遗传变异，从而诱导分化发育成的植株更稳定。

2.2实验结果图片第一次培养M1-1 M2-1 M2-2 M4-1 M3-1 培养成功M4-2 霉菌M1-2 细菌污染M3-2 细菌污染烫伤污染情况：接种8瓶，污染3瓶，5瓶未污染第二次培养1-2烫伤2-1霉菌1-1 愈伤组织2-2愈伤组织继代实验情况因未观察到，所以未附图。

3.分析讨论：3.1对实验现象、实验结果的分析及其结论3.1.1胡萝卜愈伤组织诱导实验中，被污染了5瓶，说明在整个实验过程中，一定要注意无菌操作，否则，任何一个环节染菌都会导致外植体被污染，使得实验失败。

3.1.2外植体的选择很重要，由于实验中选了根部上端，但切面比较靠内的胡萝卜，与其他组相比愈伤组织的量或是色泽方面都比较好，但切块太小，也许是因为不一样大小的胡萝卜，但消毒时间是一样的，可能使得胡萝卜组织受伤较重。

3.1.3同一小组中，或同一个人的实验结果都会不一样，这是由于个人操作差异，主要是培养基分装时没混匀，以及无菌操作不够规范，实验熟悉度不过造成的。

3.1.4外植体经过消毒等处理，可在愈伤组织诱导培养基上进行培养，诱导脱分化形成愈伤组织，并且通过改变2,4-D和KT的浓度，可以诱导愈伤组织再分化形成植物体然后再在继代培养基上可以增殖得到更多更好的愈伤组织。

3.2实验总结3.2.1植物组织培养实验一般历时较长，因此要及时将实验过程中的每一部分的操作内容以和实验数据记录下来。