等梯度反相分离 1 100％ACN 流动相
降低％ACN，直至所有谱峰分离 分离不充分 微调％ACN，控制分离度 分离不充分 改为等强度 MeOH
改为等强度 MeOH 分离不充分 改为 50/50ACN/MeOH 分离不充分 改为等强度 THF 分离不充分 改为 50/50ACN/THF 分离不充分 1:1:1 ACN/THF/MeOH 分离不充分 改换另一种 LC 方法 可见谱峰间距变化 50/50MeOH/THF 混合液 可见谱峰间距变化 ACN/MeOH 混合液
• 流动相pH、缓冲溶液浓度可显著改变分离 度； • 试样分子含可解离的基团时，流动相 要用一定pH的缓冲溶液，这样可避免出现 不对称的峰和分叉的峰，提高保留时间的 重复性。 • 酸性试样，采用偏酸性缓冲溶液，碱 性试样选用偏碱性缓冲溶液，这样可抑制 试样解离，提高分离效率。
• 缓冲溶液应具有以下一些性能： (1) 在pH=2~8之间要有大的缓冲容量； (2) 能透过检测器使用的光波； (3) 能和有机溶剂相溶； (4) 能促进平衡速度的提高； (5) 可以掩蔽吸附剂表面上的硅醇基。
等梯度反相分离
优化梯度方法的步骤
• 1 选择标准梯度条件进行首次实验
–乙腈/水5－95％25min,2ml/min或 –乙腈/水5－95％50min,1ml/min
• 2 调整梯度范围，尽可能减少色谱图开始 和结束时的时间浪费
–起始条件，使最初几个组分有足够保留和分 离 –终止条件，使最后几个组分完全出峰、完全 分离。
• 3 溶剂的梯度范围尽可能小 • 4 如果色谱峰复杂，分离较差：
–延长梯度时间 –加长柱长 –使用细粒度的柱 –降低流速以提高塔板数
• 5 一旦色谱图中能容纳所用峰，改变流 速以调整峰间距 • 6 需要进一步改变谱峰间距，改变有机溶 剂
首先调整流动相中有机相的比例，以求得足够的容 量因子k、合理的操作时间以及易于检测的谱带。
2 获得合适的分离度，各组分完全分离。
改变有机溶剂、采用缓冲溶液、改变流动相pH值， 可显著改进分离度。
分子间相互作用
• • • • • 色散力：所有分子间，分子量、分子体积 诱导力：极性分子与非极性分子间 静电力：极性分子间 氢键力：活泼氢与富电荷元素间 作用力大小： 氢键力 > 静电力 > 诱导力 > 色散力
困难样品：多员梯度
MeOH H2 O
ACN
THF
复杂样品的分析——梯度洗脱
一次初始的梯度操作通常足以判断出大约 正确的溶剂强度的流动相，使样品充分 分离，通过分析谱峰，简化分确定离条 件的步骤 建议用乙腈/水作流动相进行首次分离 乙腈操作压力低，溶剂强度高，检测波长 宽：可在185－205nm检测 其他有机溶剂：甲醇，丙醇，异丙醇，四 氢呋喃
• 反相色谱流动相：水+有机溶剂 • 最常用有机溶剂：甲醇、乙腈、四氢呋喃 • 溶剂极性越小，样品分子保留时间越短， 出峰越快； • 流动相中有机溶剂比例越大，保留时间 越短； • 流动相中有机溶剂极性越小，保留时间 越短。
• 由于乙腈、四氢呋喃的毒性，通常优先考 虑“甲醇—H2O”流动相
分离度与溶剂强度的关系
高效液相色谱实验技术
RP-HPLC分析方法的建立
1 反相色谱最常用、最经济、最简便 2 最常用的反相柱是C18柱 3 适用非极性、弱极性、中等极性物质的分离 4 强极性化合物可衍生化转为可分离物质 5 其他色谱柱（C8、C1、苯基、-CN、-NH2 正相柱）
如何卓有成效的工作
• 1 首先估价样品与分离目的（切不可低 估此步的重要性） • 2设计开始的分离条件，使之有可能在一 两次实验中，便可能得到有希望的色谱 图。 • 3 预测可能发生的问题，当问题出现时， 能用已知的办法解决。
如何卓有成效的工作
• 4 优先考虑试用最有希望的、能控制的 分离方法。 • 5 应对每次实验进行设计，能提供有用 信息。 • 6 HPLC的目的是分离，绝大多数情况下，HPLC方法的建立主要靠经 验进行 1 获得合适的保留时间，2t0 <tR < 10t0。
在反相色谱中，固定相非极性。 在反相色谱中，固定相非极性。 样品分子极性越大，保留时间越短， 样品分子极性越大，保留时间越短，出峰 越快；分子体积越大、分子量越大，保留 越快；分子体积越大、分子量越大， 时间越长，出峰越慢； 时间越长，出峰越慢； 分子中增加烷基、芳香基、-Br、-I基团 分子中增加烷基、芳香基、 、 基团 ，分子极性降低，保留时间增长； 分子极性降低，保留时间增长； 分子中增加极性基团，分子极性增大， 分子中增加极性基团，分子极性增大， 保留时间缩短； 保留时间缩短； 如：-NO2、-SO3H、-F、、 、 NH2、-COOH