·48·
中华病理学杂志 2005年 1月第 34卷第 1期 Chin J Pathol, January 2005, Vol 34, No. 1
用 (如卵白素 2生物素相互作用 )而使之被标记 , 2 nm 量子点 结合到细胞核 ,发绿光 , 4 nm 量子点结合到肌动蛋白丝 ,发 红光 ,这是量子点生物标记应用的开始 。Chan和 N ie[5 ]用巯 基乙酸处 理 的 CdSe / ZnS 量 子 点 与 转 铁 蛋 白 结 合 后 标 记 HeLa细胞 ,又将 CdSe / ZnS量子点结合上人 IgG,与特异性抗 人 IgG多克隆抗体孵育后 ,能产生广泛的凝集反应 ,这一结 果说明量子点标记免疫分子后能识别特异性抗体或抗原用 于免疫化学研究 。近几年的研究表明 ,用量子点结合抗体或 肽段 , 可 做 特 异 性 的 细 胞 或 亚 细 胞 结 构 的 标 记 。 Jaiswal 等 用 [13 ] CdSe / ZnS量子点结合抗 Pgp ( P糖蛋白 )抗体对培养 中的 HeLa细胞和 D. discoideum 细胞表面的 Pgp 进行标记 , 证实量子点荧光相当稳定 ,持续达一周以上而未淬灭 ,可追 踪标记分子在细胞生长中的动态过程 。W u 等 [12 ]用 CdSe / ZnS量子点连接上 IgG和链亲和素后 ,再结合上抗 Her2抗体 和抗核抗原 (ANA ) 同时标记了活的和固定后的乳腺癌细 胞 ,细胞表面的 Her2、胞质中的肌动蛋白 、微管 ,细胞核中的 核抗原均能很好标记 。另外 ,还有用发绿色荧光的量子点标 记线粒体 及 发橙 色 荧 光 的 量 子 点 标 记 细 胞 核 的 报 道 [7 ] 。 L idke等 [15 ]用量子点标记表皮生长因子 ( EGF) ,可高特异性 的与 EGF受体 ( erbB )结合 ,激活 erbB /HER 介导的信号传 导 。 Kaul等 [17 ]用 CdSe / ZnS量子点结合抗 Mortalin (热休克 蛋白 70 家族蛋白质 )抗体标记了正常人胎儿成纤维细胞 (W I238)和骨肉瘤细胞 (U2OS)中的 Mortalin。
作者单位 : 710061 西安交通大Байду номын сангаас生命科学与技术学院癌症研究 所
通信作者 :司履生 ( Email: slusheng@ yahoo. com )
有技术条件下 ,将光学相干断层扫描成像 ,双光子荧光显微 技术等光学非接触检测方法和量子点标示方法与计算机图 像处理法结合 ,将会成为一种极有潜力的显像手段 。更为重 要的是这一标记技术无放射线污染 。量子点是半导体制造 业广泛 使 用 的 材 料 , 曾 经 用 做 量 子 点 的 材 料 有 硒 化 镉 (CdSe) 、磷化铟 ( InP) 、砷化镓 ( GaA s) 、砷化铟 ( InA s)等 ,在 近几年的研究中硒化镉最受重视 。
1. 纳米晶体 ———量子点的特性 :纳米生物技术是目前生 物技术领域的最前沿的研究课题 ,利用纳米技术进行细胞和 动物体内显像的探索研究在国外已进行多年 [124 ] ,近年来国 内也在开展这一研究 。量子点是一种半导体晶体材料的纳 米颗粒 ,直径在 10 nm 以内 ,较普通细胞的体积小数千倍 。 1998年 Chan和 N ie [5 ]及 B ruchez等 [6 ]首次利用硒化镉 /硫 化镉 (CdSe / ZnS)和硒化镉 /硫化锌 ( CdSe /CdS)量子点成功 地标记了 HeLa细胞和 3T3成纤维细胞 。此后量子点细胞显 像越来越受到重视 。量子点纳米晶体具有吸收波长范围宽 (从紫外光 、可见光到红外光 )和发射波长范围窄的特性 ,在 一定波长光 (双光子或单光子 )的激发下 ,不同直径 、不同材 料的量子点可发射出不同的荧光 ,包括不同色调的紫 、蓝 、 绿 、黄 、橙 、红色荧光 。不同材料的量子点也会发出不同的荧 光 ,因此 ,用不同大小 、不同材料的量子点标记细胞的亚微结 构及不同蛋白 、同一细胞的不同细胞器及不同部位即可显示 不同荧光 ,而且分辨率极高 。因量子点的体积与生物大分子 (核酸 、蛋白质 )类似 ,故可以标记不同的核酸 (如 DNA ) 、蛋 白质 、病毒 [5223 ] 。与有机染料相比 ,量子点受外来光源激发 后 ,会发射光谱范围窄 (有机染料发射光谱的 1 /3)的可调的 荧光 ,散射少 ,光漂白作用很小 (比有机染料小 100 倍 ) ,同 一细胞可用多种发射不同颜色荧光的量子点同时标记 ,而且 其荧光强度较有机荧光染料高 1000 倍 ,光化学性质十分稳 定 ,不易被化学因素和代谢降解 ,荧光可持续数周或更长时 间 (可达 3周以上 ) ,能动态观察细胞及不同细胞器或蛋白 质的动力学过程 ,而且不会对组织细胞造成伤害 [5223 ] 。在现
由于量子点荧光显像这一新技术目前仅在体外或小动 物 (鼠 )体内进行 ,而且需采用双光子扫描显微镜来观察 ,仅 能观察到皮下几百微米的亚细胞分辨率的影像 ,对于大动物 (狗 、猪 , 等 ) 及 其 体 内 深 在 器 官 尚 无 法 观 察 。不 过 , Kim 等 在 [10 ] 2004年将 CdSe量子点注射到鼠的前肢皮下和猪的 腹股沟皮下 ,观察到量子点可被引流到前哨淋巴结 ,依靠卤 素光源激发 CdSe量子点发出的近红外线 ,用 CCD 相机获取 信号 ,使前哨淋巴结显像 。这为大动物显像及为临床手术中 准确切除肿瘤和受侵犯淋巴结提供了新方法 [22, 23 ] ,也为病 理诊断提供了依据 ,虽然量子点目前尚未用于病理组织切片
中华病理学杂志 2005年 1月第 34卷第 1期 Chin J Pathol, January 2005, Vol 34, No. 1
·47·
·综述 ·
量子点 :新的荧光标记物质
陈宏伟 刘红莉 王一理 司履生
随着人类基因组计划的完成 ,细胞蛋白组学 、细胞图谱 蛋白组学要求对细胞亚区 、亚结构的蛋白组成及其相互作用 网络进行动力学分析 ,而荧光图像技术是进行这一研究的重 要手段 。有机荧光染料易于淬灭 ,瞬时即逝 ,无法对标记细 胞进行长期的追踪及观察标记分子的动力学过程 。荧光蛋 白标记可以克服上述困难 ,但需使用基因工程技术制备可表 达融合蛋白的质粒 ,进行细胞培养 、基因转染等一系列操作 , 非一般实验室所能完成 ,而且 ,如要同时标记细胞中的不同 蛋白则需构建多种含不同特性荧光蛋白的融合质粒 ,更增加 了实验难度 。最近出现的纳米晶体 ( nanocrystals)即半导体 微粒 ———量子点 ( quantum dots)标记技术 ,以其独特的优点 引起人们极大注意 。
目前 ,人们对量子点的兴趣更是看重于它在肿瘤早期诊 断上的可能应用 。纳米微粒为 1～100 nm 的超微粒子 ,恶性 肿瘤细胞对其吞噬的能力远较正常组织为高 ,而且肿瘤组织 血管通透性大 ,毛细血管扭曲扩张或产生隙漏 ,致使纳米粒 子容易穿出血管而滞留于肿瘤组织 ,所以 ,利用这一原理可 对肿瘤显像 。纳米生物传感器由纳米载体与能够识别肿瘤 细胞标志物的特异性靶向分子组装而成 ,将特异性的靶向分 子 ,如特异性配体 、单克隆抗体 、核酸探针等结合在纳米微粒 表面 ,通过靶向分子与细胞表面特异性标记分子结合 ,利用 物理方法可测试传感器中的磁讯号 、光讯号等 ,可以大大提 高纳米微粒显像技术的敏感性和特异性 。目前 ,利用纳米微 粒进行肿瘤显像有两种方法 :一种是将磁性纳米微粒或带有 特异性配体的纳米微粒注入体内用 MR I显像 ; 另一种是将 纳米微粒或纳米微粒带有特异性的配体用放射性同位素标 记后 ,用发射型计算机断层扫描 ( ECT)或正电子发射断层扫 描 ( PET)显像 [124 ] 。二者对小于 1 cm 病灶的定性诊断还有 困难 。因此 ,要寻找一种诊断敏感性和特异性高 、对人危害 小 、费用低的肿瘤显像技术就显得尤为必要 。将量子点肿瘤 标志物标记后 ,与荧光成像技术相结合恰好符合这一原则 , 可能用于肿瘤早期诊断及追踪转移性肿瘤 ,在国外 ,这一方 面的研究已经开始 。
中 ,但其在细胞及活体中的应用为以后将量子点用于病理诊 断奠定了基础 。下一步 ,研究量子点荧光显像及适合人体深 部组织的光学非接触影像系统将是今后的发展方向 。
此外 ,研究表明 ,量子点对原核细胞 、真核细胞及人的细 胞无不良影响 。青蛙胚胎细胞摄取了 CdSe量子点后发育成 了正常蝌蚪 [7, 9 ] 。给鼠和猪皮下注射 CdSe量子点使其引流 到前哨淋巴结进行显像过程中及其后的数小时 ,没有发现毒 性反应 [10 ] 。镉 (Cd)元素对机体虽有潜在毒性 ,但显像所用 Cd剂量比其毒性剂量少 300倍 ,而且显像使用的是 CdSe,其 毒性大大减小 [10 ] 。但对机体是否有长期毒性仍有待研究 。
4. 量子点在活体动物及病理学中的应用 :量子点不仅 可用于 体 外 实 验 , 还 可 用 于 活 体 研 究 。 2002 年 , Akerman 等 [11 ]用可减少网状内皮系统非特异性吞噬的 PEG (聚乙二 醇 )包裹 CdSe / ZnS量子点后 ,分别与可标记肺血管内皮细 胞 、肿瘤组织血管或淋巴管 、肿瘤细胞的三种肽段结合后 ,在 体外实验中 ,证实这些分子可特异性的标记肺血管内皮细胞 及 MDA 2MB 2435人乳腺癌细胞 。Akerman等 [11 ]将上述量子 点经尾静脉注射 ,特异性的标记了裸鼠的肺血管和 MDA 2 MB2435人乳腺癌异种移植肿瘤血管 。 2003 年 , Larson将水 溶性的 CdSe / ZnS量子点经尾静脉注射给小鼠 ,通过双光子 扫描显微镜观察到皮下毛细血管高清晰度的三维影像及每 分钟 640次的毛细血管搏动 [6 ] ,这是继 Akerman等在小鼠体 内用量子点标记肺血管及肿瘤血管后的又一次动物体内量 子点荧光显像 。这种高分辨率和高信噪比的量子点标记图 像用多光子显微镜观察 ,论文发表后曾引起巨大震动 。
2. 量子点表面的修饰 :最初使用的量子点通常小于 10 nm ,较金属及磁性纳米颗粒有更小的表面积 ,其发光效率较 低 , 并 且 易 于 发 生 光 化 学 降 解 ( degradation ) 和 聚 集 ( aggregation) 。于是 ,研究者在借鉴材料科学和电子科学的 基础上 ,创造了纳米晶体能带隙工程学 ( bandgap engineering of nanocrystals) ,建立了核心 2外壳纳米晶体样本 ,即在一种 量子点的外面再包裹一层高能带隙的量子点物质 ,这样可有 效增加发光效率 ,减少非辐射松弛 ( relaxation) ,防止光化学 降解 ,更可以对其表面进行修饰 ,即在核心 2外壳的表面再加 一层物质 ,使量子点获得亲水性 ,以便应用于生物学研究 [6 ] 。 例如 ,为了增强 CdSe量子点的荧光强度 ,常在其外包被一层 硫化锌 ( ZnS) ,使荧光亮度增加 35% ～50% [5, 6, 18 ] ,而且 ZnS 能减少 CdSe量子点的降解和聚集 ,并保持稳定长达数月 [9 ] 。 CdSe / ZnS是化学合成的无机物 ,为了增加其胶体稳定性 、水 溶性和减少非特异性吸附及细胞内聚集 ,并减少被网状内皮 系统的吞噬 ,常对其进行亲水性处理 :一种是用表面活性剂 , 如二氢硫辛酸 、巯基乙酸等处理其表面 ,或用聚乙二醇 PEG 修饰包被的聚合物 ;另一种是在其表面包被蛋白质 ,如卵白 素 ( avidin) 、生物素 、链亲和素等 。这样使其表面获得亲有机 物的巯基 、羧基等活性基团 , 以结合蛋白质 、抗体 、肽或核 酸 [5, 8, 9, 12, 13, 17220 ] 。另外 ,由于 CdSe与 ZnS以静电结合而成 , 表面带负电荷 ,可结合带中性电荷或阳性电荷的蛋白质及抗 体 (如 IgG,等 ) [13, 15 ] 。还有一种方法是直接用含磷脂的亲水 性 的 聚 乙 二 醇 ( PEG2000 ) 2脑 磷 脂 ( PE, phosphatidylethanolam ine) 2卵磷脂 ( PC, phosphatidylcholine)混 合物包被 CdSe / ZnS量子点 ,整个量子点核心及磷脂类外壳 的大小 、形状 、结构规则 ,免疫原性和抗原性弱 ,含量及大小 可精确调整 [9 ] 。通过与适当抗体结合 ,便可十分容易进入细 胞内 ,特异性的标记不同的细胞 、细胞器 、蛋白质 、肽或核酸 。