第一次课举例说明人的基因组成或结构变化引起的相关疾病(要求：1特定某个基因名称、定位、大小及组成等基本特征。

2基因组成或结构变化的过程、结果和表型)。

疾病：严重复合免疫缺陷病（XL-SCID）名称：受体γ链(γc)基因突变引起。

定位：编码基因位于Xq12～131组成：γc基因8个外显子的135种基因突变，其中5个突变热点;最常见的突变类型是单个碱基置换(错义突变和无义突变)，其次为剪接部位突变、缺失和插入突变结果：该基因编码的产物为白介素（如IL-4，IL-21）。

这些白介素和受体涉及了很多T,B细胞的分化和常熟。

当基因突变时，无功能蛋白质产物生成，导致白介素信号的广泛缺失，进而引起免疫系统功能的丧失。

第三次课1、请叙述肝细胞对胰高血糖素或肾上腺素的反应过程。

简洁答案：肾上腺素能受体激活——与Gi偶联——AC活性下降——cAMP活性下降——平滑肌舒张。

胰高血糖素能受体——激活Gs、增加AC活性——cAMP——PKA（增加肝糖原分解）叙述答案：肾上腺素和胰高血糖素中的任何一种激素同肝细胞膜上相应受体结合后激化G 蛋白，G蛋白化a亚基，a亚基激化腺苷酸环化酶(AC)，AC催化小分子信使cAMP的产生，cAMP结合PKA，通过变构调节作用激化PKA，PKA通过磷酸化作用激化或抑制各种效应蛋白，继续传递信号，PKA激活磷酸化酶b激酶，促进糖原的分解代谢，糖原分解成1-磷酸葡萄糖，然后进一步分解为6-磷酸葡萄糖随后进入血液。

激活的PKA计入细胞核使cAMP反应元件结合蛋白(CREB）磷酸化。

磷酸化的CREB结合于cAMP反应元件（CRE），并与CREB结合蛋白（CBP）结合。

与CREB结合后的CBP作用于通用转录因子（包括TFIIB）,促进CFIIB 等通用转录因子与启动子结合激活基因的表达。

2、细胞膜在信号转导的过程中起到怎样的作用？答案1：屏障作用，位于细胞膜的某些能特异性地与外源性物质结婚，并诱发细胞产生某些特定的生理生化反应，并最终产生生物学效应的物质。

答案2：每个细胞在机体内并非孤立地存在，而是不断受到其生活环境中各种理化因素的影响。

各种信号，如化学、机械、电刺激信号，一般首先作用于细胞膜，膜上某些特异性蛋白质能选择性地接受某种特定信号，引起细胞膜两侧电位变化或细胞内发生某些功能改变；细胞膜的这种作用称为跨膜信号转导功能。

细胞通过位于胞膜或胞内的受体感受胞外信息分子的刺激，经复杂的细胞内信号转导系统的转换而影响其生物学功能，这一过程称为细胞信号转导，这是细胞对外界刺激做出应答反应的基本生物学方式。

其中，水溶性信息分子如肽类激素、生长因子及某些脂溶性信息分子(如前列腺素)等，不能穿过细胞膜，需通过与膜表面的特殊受体相结合才能激活细胞内信息分子，经信号转导的级联反应将细胞外信息传递至胞浆或核内，调节靶细胞功能，这一过程称为跨膜信号转导。

其过程包括：①胞外信号被质膜上的特异性受体蛋白识别，受体被活化；②通过胞内信号转导物(蛋白激酶，第二信使等) 的相互作用传递信号；③信号导致效应物蛋白的活化，引发细胞应答(如激活核内转录因子，调节基因表达)。

脂溶性信息分子如类固醇激素和甲状腺素等能穿过细胞膜，与位于胞浆或核内的受体结合，激活的受体作为转录因子，改变靶基因的转录活性，从而诱发细胞特定的应答反应。

第四次课1.试述外源基因在原核体系中的表达需要具备的条件，及影响外源基因表达的因素。

外源基因表达所要具备的条件︰（1）编码区不含插入序列（mRNA-cDNA）;(2)位于启动子下游，方向一致，原有的读码框不变；（3）含起始密码子（AUG）,终止密码（TAA）;(4)转录的必须有SD序列，调节SD序列与第一个AUG间的距离；（5）选择系统编号的简并密码；（6）增强产物的稳定（如︰融合蛋白，信号肽）。

影响因素︰（1）启动子的强弱（主要因素）；（2）基因的剂量；（3）RNA转录效率（SD互补，AUGSD距离及序列，AUG前后核苷酸序列的适宜性）；（4）密码子；（5）表达产物的大小；（6）产物的稳定性。

2.蛋白质的分离纯化技术依据蛋白质的性质分为哪几大类，请列举其中的一类，谈谈它的原理及应用。

蛋白质的分离纯化可分为︰①依据溶解度差别，如硫酸铵分离法；②依据分子大小不同︰透析、超过滤、离心法、凝胶过滤层析、凝胶电泳；③依据蛋白质分子带点性质不同︰电泳、离子交换层析；④依据蛋白质吸附性质不同︰吸附柱层析、吸附薄层层析；⑤利用蛋白质的特异性配体︰亲和层析。

举例︰电泳。

其原理︰在一定PH值下，细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动，向正极或负极移动。

各种细胞或处于不同生理状态的同种蛋白质所带电荷的电量不同，故在一定的电场中的泳动速度也不同。

（影响颗粒电泳迁移率的因素︰缓冲液，电场，支持介质）类型︰SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点聚焦电泳、毛细管电泳。

应用︰电泳的类型很多，应用范围也很广，如︰SDS-PAGE，常用于蛋白质分子量的测定︰目前，双向凝胶电泳已成为蛋白质组学研究的重要技术。

3.以人GM-CSF为例，写出获得该基因工程重组蛋白纯品的流程。

1、GM—CSF全基因及可溶性sGM—CSF基因PCR扩增。

2、含肠激酶位点的pth10HisA·sGM —CSF表达载体的构建（纯化后的GM—CSF，sGM—CSF及质检）。

3、诱导表达pth10HisA·sGM —CSF在大肠杆菌BL21中诱导表达。

4、sGM—CSF融合蛋白的制备<1度工程菌的培养2度超声破坏菌体。

5、sGM—CSF融合蛋白的纯化<1度融合表达载体pthhisa在硫氧还蛋白融合段有组氨酸标签，用M2+固相化的chelating sepharose fast flow 填材料进行亲和，层析2度将可溶性表达产物（超声波，噬菌体的离心上清）与亲和柱结合，用2信柱床体积以上的A液过柱至基线平稳，用B液（A液加入朱唑至浓度为50mmol/L)梯度习脱5—10个柱体体积，用AKATA Explore进行检测，收集各洗脱液）。

6、sGM—CSF融合蛋白的肠激酶切割及纯化。

7、sGM—CSF融合蛋白及非融合蛋白的western Blot检测。

第五次课一、基本概念1.siRNA：引导RNA：在RNAi的起始阶段，加入了dsRNA或内源性pre-miRNA被Dicer酶切割为19-23nt 长的小分子，用于干扰dsRNA。

siRNA (Small interfering RNA)，是一种小RNA分子（~21-25核苷酸），由Dicer（RNAase Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成。

SiRNA是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默。

2.miRNA：大小约21-23个碱基的ssRNA，有具有发夹结构的约70-90个碱基的ssRNA前体经Dicer酶加工生成。

是非编码RNA，参与调控基因表达，但其机制区别于siRNA介导的mRNA降解。

具有高度的保守型，时序性和组织特异性。

MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20~25个核苷酸。

成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex,RISC），通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。

最近的研究表明miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。

3.Dicer proteinRNaseⅢ家族成员之一，可特异识别dsRNA，以来ATP逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等方式引入的dsRNA（或pri-miRNA），将RNA降解为3’端有2个碱基突出的19-23bp 的dsRNA（siRNAs）。

该酶是一种核糖核酸内切酶，属于RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(dsRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。

4.RISC一种RNA-蛋白质复合物，通过与目标mRNA完全护着部分的互补配对来实施切割或者翻译抑制的功能。

siRNA组装siRISC，miRNA组装miRISC。

RISCs包括两种类型：切割型和不切割型，这由RISC当中的AGO蛋白决定。

RNA诱导沉默复合体（英语：RNA-induced silencing complex，RISC）：一种由siRNA与Argonaute 蛋白和Dicer酶复合形成的复合物。

在RNAi中，利用siRNA的反义链切割靶mRNA，达到基因沉默5.PTGS转录后基因沉默：在基因转录后的水平上通过对靶RNA进行特异性降解而使其失活。

二、请说明RNAi的作用机制病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。

宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23 bp），即siRNA。

siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA 再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。

RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。

被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。

siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。

答：dsRNA进入细胞内，被一种具有类似RNase tlI活性的核酸内切酶Dicer结合，并被酶切成19～23nt的小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)，在ATP的作用下，siRNA与由多种蛋白质结合形成且具有活性的RNA沉默复合物(RNA—in—duced silencing co1TIpiex，RISC)结合，RISC具有解螺旋酶的功能，使与其结合的siRNA双链解螺旋成单链，释放正义链，保留反义链，随后识别并结合细胞内与其反义链相互补的mRNA链。