基因工程1. 基因工程的DNA聚合酶有几类主要有哪些活性（1）依赖于DNA的DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（全酶）；大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段）、耐热的DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）等。

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（全酶）具有三种活性：①5’→3’DNA聚合酶活性，以单链DNA为模板，以带3’自由羟基的DNA片段为引物；②5’→3’外切核酸酶活性，从5’端既降解双链DNA，也降解RNA-DNA杂交体中的RNA链（RNA酶H活性）；③3’→5’外切核酸酶活性，底物为带3’自由羟基的双链DNA或单链DNA。

主要用于：①以切刻平移法标记DNA；②对DNA 分子的3’突出尾进行末端标记。

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段）5’→3’DNA聚合酶活性，以单链DNA为模板，以带3’自由羟基的DNA片段为引物。

3’→5’外切核酸酶活性，底物为带3’自由羟基的双链DNA或单链DNA。

Taq DNA聚合酶具有一种活性：5’→3’DNA聚合酶活性，以单链DNA为模板，以带3’自由羟基的DNA片段为引物。

主要用于：①对DNA进行测序；②通过聚合酶链式反应对DNA分子的特定序列进行体外扩增。

（2）依赖于RNA的DNA聚合酶（即逆转录酶）: 优先以RNA为模板，也可以DNA为模板。

逆转录酶能以RNA为模板催化合成双链DNA。

:逆转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）具有两种活性：①5’→3’DNA聚合酶活性，以RNA 或者DNA为模板，以带3’自由羟基的RNA或DNA片段为引物;②RNA酶H活性，即5’→3’外切核糖核酸酶活性，特异地降解RNA-DNA杂交体中的RNA。

逆转录酶无3’→5’外切核酸酶活性，即无校对功能，其催化的聚合反应容易出错。

(3)末端脱氧核苷酸转移酶（简称末端转移酶）:不以DNA或RNA为模板，只是将核苷酸加到已有DNA分子的末端。

末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶）具有一种活性：即末端转移酶活性，在二价阳离子存在下，其催化dNTP加于DNA分子的3’-羟基端。

主要用于：①给载体DNA或cDNA加上互补的同聚尾; ②以32P标记的一种dNTP或一种rNTP来标记DNA片段的3’端。

2. 基因工程的大肠杆菌载体有哪些，各有什么特点3. 琼脂糖凝胶电泳的原理有什么特点、基本原理：在生理条件下，核酸分子之间糖－磷酸骨架中的磷酸基团呈离子化状态。

当核酸分子被放置在电场中时，它们会向正电极方向迁移。

由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此，它们能以同样的速度向正电极方向移动，即电泳的迁移率，取决于核酸分子自身的大小和构型。

特点：（1）琼脂糖是一种线性多糖聚合物，当其加热到沸点冷却凝固会形成良好的电泳介质，其密度由琼脂糖的浓度决定；（2）经过化学修饰的低熔点（LMP）的琼脂糖，在结构上比较脆弱，低温下熔化，可用于DNA片段的制备电泳。

LMP可不经过电洗脱或破碎凝胶，用来回收DNA分子；（3）无毒，凝胶过程中不需要催化剂、加速剂，不会发生自由基聚合；（4）分辨率: ～50kb。

4. 多聚酶链式反应（PCR）的基本原理PCR反应体系的组成基本原理：（1）在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，利用DNA聚合酶催化合成反应，体外扩增特异DNA片段。

（2）能够指导特定DNA序列的合成。

（3）使特定DNA区段得到了迅速大量的扩增。

反应条件。

94℃变性30s；55℃复性30s；70～72℃延伸30～60s。

一共进行30轮左右的循环。

反应体系：（1）模板。

待测的核苷酸（DNA或RNA）分子；双链DNA可直接用于反应，而RNA则需要用反转录酶反转录成为cDNA，然后用作聚合酶反应的模板。

（2）DNA聚合酶。

最初采用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段或T4 DNA聚合酶催化。

由于每轮反应需要三个温度点，因此采用耐热TaqDNA聚合酶。

（3）一对引物。

人工合成的、长度通常为20～24个核苷酸。

（4）四种三磷酸脱氧核苷（即dNTP），是合成DNA所需的原料。

（4）适当的缓冲液体系。

用于PCR的标准缓冲液内一般含：50mmol/L KCl、10mmol/L Tris-HCl（，室温）、L MgCl2。

@5. 常用目的基因制备的方法及其原理已知基因部分核苷酸序列或全部核苷酸序列，基因的制备方法主要分为两大类：一类是基因化学合成法，一类是基因生物制备法。

一般又可将基因生物制备法分为基因组文库法、cDNA 文库法和PCR法等。

（一）基因化学合成法DNA的化学合成方法主要有磷酸二酯法、磷酸三酯法、固相亚磷酸酰胺法等。

磷酸二酯法是最初发明的化学合成基因的方法，而固相亚磷酸酰胺法是目前绝大部分DNA自动合成仪所使用的方法。

基因的化学合成法主要用于PCR扩增引物、核酸测序引物和合成接头等寡核苷酸片段的合成。

（二）基因组文库法基因工程中，将某种生物全部基因组的遗传信息，贮存在可以长期保存的稳定重组体中，以备需要时能够随时应用它分离所需要的目的基因，这种保存基因组遗传信息的材料，称为基因组文库。

一种直接从基因组中分离目的基因的方法。

、（三）cDNA文库法cDNA文库：指汇集以某种生物体成熟mRNA为模板逆转录而成cDNA序列的重组DNA群体。

在基因工程中，cDNA文库法是从真核生物细胞中分离目的基因的常用方法。

（四）PCR法一般经典的PCR法可用于已知核苷酸序列核酸片段的特异扩增；而一些改进的PCR 法可用于一些未知核苷酸序列核酸片段的特异扩增。

6. 重组转化体导入到受体细胞的方法有哪些各有什么特点(1)转化（transformation）：将重组质粒导入受体细胞，使受体菌遗传性状发生改变的方法。

|(2)转染（transfection）: 将携带外源基因的病毒感染受体细胞的方法。

根据受体生物，一般可将重组体导入受体细胞的方法主要分为大肠杆菌转化法、酵母转化法、植物细胞转化法和动物细胞转化法。

7. 筛选重组转化体的方法有哪些（一）利用表型特征进行筛选利用载体提供的表型特征进行筛选（1）抗药性标记基因插入失活筛选法；（2）β－半乳糖苷酶显色反应筛选法。

"利用噬菌斑的形成进行筛选（1）以λ噬菌体载体与外源DNA构建的重组体筛选主要依赖于重组体的大小及形成噬菌斑的能力；（2）重组体DNA只有在为野生型λ噬菌体DNA的75%～105%的长度时，才能在培养平板上形成清晰的噬菌斑，而载体DNA自身不会包装成活的噬菌体颗粒。

（二）物理筛选鉴定法电泳检测法根据DNA分子质量的大小，以凝胶电泳检测重组体。

R-环检测法R-环：指RNA通过取代与其序列一致的DNA单链而与另一单链DNA杂交，被取代的DNA单链与RNA-DNA杂交双链所形成的环状结构。

;R-环结构一旦形成就十分稳定。

应用R-环检测法可鉴定出双链DNA中存在的与特定RNA 分子同源的区域（可在电子显微镜下观察）。

8. 查阅资料，综述基因工程技术在食品工业中的应用。

酶工程1.酶提取和分离纯化的方法有哪些酶提取常用的方法：盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取、有机溶剂提取。

；纯化常用的方法：沉淀法、超滤法、色谱分离法、结晶法等。

其中沉淀法和超滤法既可用于初步纯化，也可用于精制。

理想的提取和分离纯化方法：在提高酶的比活的同时，要求酶回收率高，提取步骤少、工艺简单，成本低。

2.什么是酶的活力和比活力酶活力测定的基本步骤有哪些比活力：每毫克酶蛋白具有的酶活力单位数。

一般情况下，酶的比活力随酶的纯度的提高而提高。

酶的纯度也可用酶的比活力来衡量。

在恒温反应系统中进行酶促反应，间隔一定的时间，分几次取出一定容积的反应液，使酶停止作用，然后分析产物的生成量或底物的消耗量。

3.酶的固定化方法有哪些各有什么优缺点1.吸附法（1）物理吸附法。

酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方法。

吸附的载体：包括无机载体（活性炭、石英砂、多孔玻璃、氧化铝、硅胶、磷酸钙）和有机载体（淀粉、谷蛋白、纤维素、葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺）等。

`优点：具有不破坏酶活性中心和酶高级结构变化少，若能找到适当的载体，这是简单的好方法。

缺点：酶与载体结合力弱、酶易脱落等。

（2）离子吸附法。

通过离子效应，将酶分子固定到含有离子交换基团的固相载体上。

常见的载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CM-纤维素、DOWEX-50等。

优点：操作简单，处理条件温和，能得到酶活回收率较高的固定化酶。

缺点：酶与载体的结合力较弱，当离子强度高、缓冲液种类或pH值发生变化时，酶容易脱落。

2.化学结合法（1）共价结合法。

将载体有关基团活化、与酶分子上的功能团发生化学反应形成共价键的一种固定化方法，是研究得最多的固定化方法之一。

（可与载体结合的酶的功能团：α或ε-NH2，α、β或γ-羧基，巯基，咪唑基，酚基等，但参与共价结合的氨基酸残基应当是酶催化活性的非必需基因，否则可能会导致固定后酶活力完全丧失。

特点：反应条件苛刻，操作复杂，容易使酶的高级结构发生变化而破坏活性中心，操作时需注意。

（2）共价交联法。

通过双功能或多功能试剂（交联剂），在酶分子之间或酶分子与微生物细胞之间形成共价键的连接方法。

它与共价结合法的区别是它使用交联剂而不用载体。

常用的交联剂：戊二醛、异氰酸酯、顺丁烯二酸酐和乙烯共聚物等。

特点：反应条件比较激烈，固定化酶的活力回收率较低，但尽量降低交联剂浓度和缩短反应时间，会有助于固定化酶比活力的提高。

3.包埋法可分为凝胶网格型和微囊型。

将酶或微生物包埋在高分子凝胶网格中的包埋法称为凝胶网格包埋型，将其包埋在高分子半透膜中的包埋法称为微囊型。

优点：一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基起结合反应，较少改变酶的高级结构，酶活力的回收率较高。

.缺点：仅适用于小分子底物和产物的酶，因为只有小分子物质才能扩散进入高分子凝胶的网格，并且这种扩散阻力还会导致固定化酶动力学行为的改变和酶活力的降低。

（1）凝胶网格型。

采用明胶、卡拉胶、海藻酸钠或淀粉等天然高分子化合物作为包埋剂时，可以将酶直接与溶胶态的包埋剂混合凝胶化。

缺点：凝胶孔径不规则，有一部分大于平均孔径，时间稍长时，酶容易泄漏。

常与交联法结合达到加固的目的，如先用明胶包埋，再用戊二醛交联等。

4.固定化酶的性质和评价指标固定化酶（细胞）的性质1.酶活力的变化酶经固定化后，酶分子的构象可能改变，导致了酶与底物结合能力或催化底物转化能力发生变化；载体的存在给酶的活性部位或调节部位造成某种空间障碍，影响酶与底物的作用；酶包埋于载体，底物必须扩散进入载体才能和酶分子接触，扩散速率的不同限制了酶与底物的作用。

2.酶稳定性的变化@经固定化后，大多数酶的稳定性提高，这对实际应用十分有利。

固定化酶的稳定性常用半衰期（t1/2）表示，即固定化酶活力降为最初活力一半所经历的连续工作时间。